Duyuru

Collapse

Devamını görüntüle
See less

Peygamber Süpürgesi, Aremisia Annua

Collapse
X
  • Filtrele
  • Zaman
  • Göster
Hepsini Sil
new posts

  • Peygamber Süpürgesi, Aremisia Annua

    Artemisia annua bitkisel preparatının antitümör aktivitesi ve aktif bileşenlerin tanımlanması

    Yazar bağlantıları bindirme panelini açarSophia J. Lang birMichael Schmiech birSusanne Hafner birHıristiyan Paetz bCarmen steinborn cRoman Huber cMenna El Gaafary bir dKatharina Werner birChristoph S. Schmidt birTatiana Syrovets birThomas Simmet bir
    Daha fazla göster
    Mendeley'e ekle
    Paylaş
    Anmak
    https://doi.org/10.1016/j.phymed.2019.152962Hakları ve içeriği alın
    Creative Commons lisansı altında
    açık Erişim tarafından atıfta bulunulan Michael Schmiech, Sophia J. Lang, Tatiana Syrovets, Thomas Simmet
    Artemisia annua bitkisel preparatının sitotoksik aktivitesine ve aktif bileşen analizi için nicelleştirme yönteminin doğrulanmasına ilişkin veriler
    Kısaca Veriler, Cilt 27, Aralık 2019, Sayfa 104635
    PDF İndirSoyut

    Arka plan

    Artemisia annua L., antikanser aktivitesi nedeniyle artan bir ilgi görmüştür . Bununla birlikte, artemisinin yanı sıra , bitkisel preparatların olası biyoaktif bileşenlerive ilgili bitkisel preparatlar hakkında daha az şey bilinmektedir. Artemisinin yanı sıra, yöntemler

    MDA-MB-231 üçlü negatif insan meme kanseri (TNBC) hücreleri ile birlikte diğer tedaviye dirençli, metastatik kanser hücre dizileri , C NMR spektroskopisini araştırmak için kullanıldı ve UHPLC-MS/MS ile nicelendirildi. Hücre canlılığı ve çeşitli apoptotik parametreler, akış sitometrisi ile ölçülmüştür. Kanser modelleri, piliç chorioallantoic membran ı (CAM) tahlili ve ortotopik meme içinde kanseri ksenograftlarının olarak çıplak fareler . birlikte, bitkisel bir preparasyon olarak pazarlanan Artemisia annua özütünün kanser önleyici etkinliğini in vitro ve in vivo saptanabilir artemisinin (tespit sınırı = 0,2 ng/mg). Özüt, HPLC-DAD ile özelliği tayin edilmiş ve en bol bileşikler ile tanımlandı 1 H- ve 13In vitro veriler iki in vivo olarak doğrulanmıştır Sonuçlar

    Artemisia annua 2'dekiAktivitesi asetonitril maserasyonu ile arttırılabilen ekstrakt, meme (MDA-MB-231 ve MCF-7), pankreas (MIA PaCa-2), prostat (PC-3), küçük hücreli olmayan akciğer canlılığını inhibe etmiştir. kanser (A459) hücreleri, oysa normal meme epitel hücreleri, lenfositler ve PBMC , ekstrakt tedavisine nispeten dirençliydi. Benzer şekilde, ekstrenin en bol bulunan bileşenleri, chrysosplenol D, arteannuin B ve castisin, ancak arteannuic asit veya 6,7- dimetoxycoumarin değil , MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin canlılığını inhibe etti . Ekstrakt, tedaviden sonraki 24 saat içinde çok çekirdekli kanser hücrelerinin birikmesine neden oldu, hücre döngüsünün S ve G /M fazlarındaki hücre sayısını artırdı , ardından hücre kaybımitokondriyal membran potansiyeli , kaspaz 3 aktivasyonu ve apoptotik hipodiploid hücre popülasyonunun oluşumu. Bundan başka, ekstre, kanser hücresi çoğalmasını inhibe tümör büyümesi ve uyarılmış azalma apoptoz içindeTNBC, MDA-MB-231 ksenograftları CAM ve aynı zamanda çıplak farelerde büyümüş. in vivo Çözüm

    Artemisinin eksikliği olan bir Artemisia annua bitkisel preparatının özü, üçlü negatif insan meme kanserine karşı güçlü antikanser aktivite sergiler. Artemisia annua özütünün potansiyel antikanser aktivitesine sahip yeni aktif bileşenleri tanımlanmıştır. grafik soyut

    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indir (122KB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir
    anahtar kelimeler

    Artemisia annua özü
    Meme kanseri
    TNBC
    apoptoz
    Hücre döngüsü
    KAM Kısaltmalar

    ACN
    asetonitril
    ALT
    alanin aminotransferaz
    AST
    aspartat aminotransferaz
    ATCC
    Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu
    KAM
    civciv korioallantoik zar
    ΔΨ m
    mitokondriyal membran potansiyeli
    CFSE
    karboksifloresein diasetat süksinimidil ester
    BABA
    diyot dizi dedektörü
    DMEM
    Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı
    DMSO
    dimetil sülfoksit
    DNA
    deoksiribonükleik asit
    ESI
    elektrosprey iyonizasyon
    FCS
    fetal buzağı serumu
    FITC
    floresan izotiyosiyanat
    O
    hematoksilen ve eozin boyama
    HP-β-CD
    (2-hidroksipropil)-β-siklodekstrin
    HPLC-MS
    yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi
    IC 50
    yarı maksimum inhibitör konsantrasyon
    LOD
    Algılama limiti
    NMR
    nükleer manyetik rezonans
    NSCLC
    kucuk hucreli olmayan akciger kanseri
    PBS
    fosfat tamponlu tuzlu su
    PBMC
    periferik kan mononükleer hücreleri
    ROS
    Reaktif oksijen türleri
    RT
    oda sıcaklığı
    TNBC
    üçlü negatif insan meme kanseri
    TÜNEL
    terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick uç etiketleme
    XTT
    2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-2H-tetrazolyum-5-karboksanilid
    UHPLC-MS/MS
    ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi - tandem kütle spektrometrisi Tanıtım

    Şifalı bitki Artemisia annua L. geleneksel çay ya da basın suyu şeklinde Asya ve Afrika genelinde sıtma tedavisinde kullanılır. Seskiterpen lakton Artemisinin aktif madde olarak tanımlandı Artemisia annua özleri ( Slezakova ve Ruda-Kučerová, 2017 ) . Son yıllarda, Artemisia annua preparatları antikanser özellikleri nedeniyle artan bir ilgi görmüştür. Artemisinin zayıf biyoyararlanımı nedeniyle, çoğunlukla artemisinin yarı sentetik türevleri, kansere ve altta yatan moleküler etki biçimlerine karşı etkinlikleri açısından araştırıldı. Gerçekten de, bazıları şu anda klinik çalışmalarda test edilmektedir (Eferth, 2017 ). Bununla birlikte, mevcut kanıtlar, artemisinin bu tıbbi bitkinin en aktif antikanser bileşeni olmayabileceğini düşündürmektedir ( Efferth ve diğerleri, 2011 , Ferreira ve diğerleri, 2010 ). Bitki, çok sayıda başka biyolojik olarak aktif madde içerir ( Ferreira ve diğerleri, 2010 , Wang ve diğerleri, 2009 ), Artemisia annua'nın yeni bir bitkisel antikanser terapötik kaynağı olabileceğini düşündürür. Bitkisel müstahzarlar olarak pazarlanan Artemisia annua özlerinin uygulanması hakkında bazı olumlu vaka raporları olmasına rağmen , genel olarak Artemisia annua özleri hakkında daha az şey bilinmektedir.malign hastalıklardan muzdarip insanlar ve evcil hayvanlarda ( Breuer ve Efferth, 2014 , Efferth, 2017 ).

    Doğal ürünler, potansiyel farmakoterapötik değeri olan yeni moleküler yapıların tanımlanması için çok önemli bir kaynak olarak kabul edilmiştir ve halen de kabul edilmektedir ( Atanasov ve diğerleri, 2015 , Koehn ve Carter, 2005 , Nosrati ve diğerleri, 2018 ). Bu nedenle, bitkisel preparat olarak pazarlanan bir Artemisia annua ekstraktını kimyasal olarak karakterize ettik ve fraksiyonladık . Ayrıca, ekstraktın en bol bulunan bileşenlerini belirledik ve hiçbir artemisinin içermediğini doğrulanabilir bir şekilde gösterdik. Artemisia annua'yı daha da analiz ettik. Terapötik etkinliğini kanıtlamak ve artemisinden farklı aktif maddeleri tanımlamak amacıyla yüksek oranda metastatik üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerine karşı aktivitesi için özüt.Malzemeler ve yöntemler

    Genel deneysel prosedürler

    Momundo Artemisia annua özü (PZN 5466281) MoMundo GmbH'den (Bad Emstal, Almanya) elde edildi. Arteannuin B ve arteannuik asit , Carbosynth'ten (Berkshire, UK), castisin ve Extrasynthese'den (Genay cedex, Fransa) 6,7-dimethoxycoumarin ve ChemFaces'ten (Wuhan, Hubei, Çin) chrysosplenol D idi. Stok çözeltiler, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlandı ve ortam ile daha da seyreltildi. Ortamdaki son DMSO konsantrasyonu, tüm deneylerde %0.5 idi. Propidium iyodür , DNaz içermeyen RNaz A , (2-hidroksipropil)-β-siklodekstrin (HP-β-CD), paklitaksel ve doksorubisin hidroklorürSigma'dan (St. Louis, MO) idi. XTT (2,3-bis-(2‑metoksi‑4-nitro-5-sulfophenyl)−2H-tetrazolium-5-carboxanilide) hücre proliferasyon testi, Roche Diagnostics'ten (Filderstadt, Almanya) satın alındı. Kaspaz 3/7 substratı (Z-DEVD-R110), Bachem'den (Bubendorf, İsviçre) elde edildi ve mitokondriyal potansiyel sensörü JC-1, Molecular Probes'tan (San Diego, CA) elde edildi.

    İçin ksenograft farelerde tedavi Momundo ekstresi ile yıkanıp HP-β-CD kompleksleri meydana gelmiştir. Bunun için öz, etanol/su (1:1, v/v) içinde çözündürüldü ve HP-β-CD, etanol içinde çözündürüldü. Her iki solüsyon 2.5 saat süreyle 1:11 kütle oranında karıştırıldı ve vakumla konsantre edildi, ardından liyofilizasyon yapıldı. Kompleksler , Momundo özütünün %0.9 NaCl içinde in vivo uygulaması için kullanıldı .Özler

    Ticari Momundo kapsülleri olarak elde edilen Momundo özütü , doğrudan DMSO içinde çözündürüldü. Momundo-ACN özü, sürekli karıştırma sırasında oda sıcaklığında 1 saat boyunca asetonitril içinde 80 mg/ml kapsül içeriğinin maserasyonuyla hazırlandı . Santrifüjden sonra süpernatan yeni bir tüpe aktarıldı ve çözücü bir nitrojen akımı altında buharlaştırıldı ( Şekil 1 A).
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (827KB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şekil 1 . Momundo Artemisia annua özlerinin fraksiyonlanması ve analitik karakterizasyonu . (A) Ekstrakt hazırlığının şematik sunumu. ACN, asetonitril . (B) 210 nm'de Momundo ve Momundo-ACN özütlerinin HPLC-DAD parmak izi ve tanımlanan bileşiklerin kimyasal yapıları. (C) UHPLC-MS/MS ile izole edilmiş bileşiklerin miktar tayini, ortalama ± SD, n  = 3. (D) Momundo ekstreleri , HPLC-MS/MS ile analiz edildiği gibi artemisinin içermez .Momundo ekstraktlarının fraksiyonlanması ve analitik karakterizasyonu

    Artemisia annua ekstraktlarının parmak izi karakterizasyonu ve fraksiyonasyonu yarı hazırlayıcı HPLC ile yapıldı . HPLC sistemi, düşük gradyanlı bir LC-9A Shimadzu pompasından (Kyoto, Japonya), otomatik numune enjektörü Aspec'ten oluşuyordu.XL (Abimed, Langenfeld, Almanya), kolonlu fırın IWN CH100 (Junedis, Gröbenzell, Almanya), bir fotodiyot dizi dedektörü UVD 340 U (Dionex, Idstein, Almanya) ve bir fraksiyon toplayıcı (Gilson, Limburg-Offheim, Almanya) Chromeleon Yazılımı sürüm 6.6 (Dionex) çalıştıran bir bilgisayara bağlı. Ayırma ve fraksiyonlama için bir ön kolon (Phenomenex, SecurityGuard, C18, 4 x 3 mm) ve bir yarı-preparatif kolon (Phenomenex, Synergi Hydro-RP, 4 um, 80 Â, 250 x 10 mm) kullanıldı. 100 mg/ml Momundo-ACN özütü, DMSO içerisinde çözündürüldü ve enjeksiyondan önce 0.45 um'lik bir membran filtreden süzüldü. Akış hızı 5000 ul/dakika ve enjeksiyon hacmi 200 ul idi. Fotodiyot dizi dedektörü, absorbans takibi için 210 nm'ye ayarlandı. seyrelme eğilimieluent A (deiyonize, ultra saf su + %0.05 formik asit) ve eluent B'den (asetonitril + %0.05 formik asit) oluşuyordu. Prosedürün ayrıntıları Kısa Veriler makalesinde açıklanmıştır.

    Ana piklere, a, b, c, d, e'ye ( Şekil 1 B) karşılık gelen fraksiyonlar toplandı ve çözücü çıkarıldı. Yapılar HPLC-MS/MS ile alıkonma süreleri, kütle spektrumları ve parçalanma kütle spektrumları referans standartlarla karşılaştırılarak tanımlandı. Doruk B (chrysosplenol D) 'ye ek tabi tutuldu 1 H- ve 13 bir Bruker DRX 500 NMR spektrometresi C NMR spektroskopisi. HPLC-MS/MS analizi, bir elektrosprey iyonizasyon yoluyla bir AB API 2000 (Applied Biosystems, Foster City, CA) üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi ile birleştirilmiş bir Agilent 1260 Infinity sistemi (Agilent, Santa Clara, CA) üzerinde gerçekleştirildi.(ESI) kaynağı. Toplanan veriler Analyst 1.6.1 yazılımı (Ab Sciex, Framingham, MA) ile işlendi.

    Ana bileşenlerin miktar tayini, bir ön sütunlu (Phenomenex, SecurityGuard, C18, 4 x 2 mm) bir analitik UHPLC kolonu (Dr. Maisch ReproSil-Pur Basic-C18, 1.9 um, 75 x 2 mm) kullanılarak yapıldı. Akış hızı 350 µl/dk ve enjeksiyon hacmi 2 µl idi. Mobil faz elüent A (ultra saf su +% 0.05 formik asit) ve yıkama sıvısı B'nin (asetonitril +% 0.05 formik asit) oluşmaktaydı. Başlangıç ​​koşulları, %70 eluent A ve %30 eluent B idi, ardından 6.9 dakika boyunca %95 eluent B'ye doğrusal bir gradyan, ardından 9.1 dakikaya kadar %95 eluent B idi. Daha sonra, 9,5 dakikaya kadar başlangıç ​​koşullarına doğrusal bir gradyan ve 12,5 dakikaya kadar yeniden dengeleme uygulandı. Kromatografik sistemi stabilize etmek için kolon 28°C sıcaklıkta tutuldu.°C. MS/MS analizi, pozitif atmosferik basınç ESI modunda ve çoklu reaksiyon izleme (MRM) algılama modunda gerçekleştirilmiştir. 6,7-dimetoksikumarin için m/z 207.1'deki öncü iyon ve m/z 151.1'deki en yüksek yoğunluğa sahip ürün iyonu seçildi. Benzer şekilde, en iyonları , m / z 361.3 ve 327.8 chrysosplenol D kullanıldı, m / z 375.4 ve 342.0 casticin ve kullanıldı , m / z 249.3 ve 142.9 B. Arteannuic asit negatif iyonizasyon modunda analiz edildi Arteannuin için kullanılmış ve içinde izleme seçilmiş iyonun en (SİM) algılama modu , m / z233.2. Bileşiklerin miktar tayini, harici bir kalibrasyon yöntemi kullanılarak yapıldı. Karakterizasyon ve doğrulama verilerinin ayrıntıları Kısa Veriler makalesinde açıklanmıştır.Hücre kültürü

    Cell Biolabs, Inc.'den (San Diego, CA) alınan ateş böceği lusiferazını kararlı bir şekilde eksprese eden MDA-MB-231 hücreleri , Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM, 4.5 g/l glukoz, GlutaMax; Life Technologies, Carlsbad, CA) kültürlendi. %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 0.1 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin ve 100 mg/ml streptomisin ile . American Type Culture Collection'dan (ATCC, Rockville, MD) alınan normal meme epitel hücreleri hTERT-HME1, MEGM ortamında (Lonza, Basel, İsviçre) kültürlendi. Ek olarak kullanılan hücre hatları MCF-7, MIA PaCa-2, PC-3 ve A549, ATCC'den alındı ​​ve tedarikçinin tavsiyelerine göre kültürlendi. Periferik kan mononükleer hücreleri(PBMC), sağlıklı donörlerin tam kanından Biocol (Biochrom GmbH, Berlin, Almanya) kullanılarak yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile izole edildi ve %10 FCS ile takviye edilmiş 2 mM L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA) RPMI 1640 ortamında kültürlendi. ve penisilin/streptomisin ( Li ve diğerleri, 2012 ). Lenfosit proliferasyonunun analizi için , CFSE lekeli hücreler ekstrakt ile muamele edildi, 72 saat boyunca anti-CD3/CD28 antikorları ile uyarıldı ve daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi ile analiz edildi ( Steinborn ve diğerleri, 2018 ). İnsan kan hücrelerinin kullanıldığı deneyler Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.Hücre canlılığının analizi

    Ekstraktlar, saf bileşikler ve doksorubisin ile muameleden sonra hücre canlılığı , üreticinin talimatlarına (Roche) göre XTT tahlili ile analiz edildi . Absorbans, 630 nm'lik bir referans filtre ile 450 nm'de bir Infinite M1000 PRO Tecan plaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür.Hücre döngüsü analizi

    Momundo, Momundo-ACN, paklitaksel veya %0.5 DMSO ile işleme tabi tutulan MDA-MB-231 hücreleri toplandı ve gece boyunca %70 buz gibi soğuk etanol ile sabitlendi. DNA, DNAz içermeyen RNaz A içeren bir tampon içinde propidyum iyodür ile boyandı ( Morad ve diğerleri, 2011 ) ve hücreler, bir FACVerse sitometresi (Becton Dickinson, Heidelberg, Almanya) ve FlowJo yazılımı (FlowJo LLC, Ashland ) kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi. , VEYA). Hücreler, yukarıdaki gibi tedavi, ancak, 24 saat boyunca, boyandı Alexa Fluor ® 488 α-tübülin antikoru (Celi Signalling Technology, Danvers, MA) ve Hoechst 33342 ( El Gaafary ve ark. 2017 ) ve bir Ti-e ters ile görüntülenmiş x40 objektif kullanan floresan mikroskobu (Nikon, Düsseldorf, Almanya).apoptoz analizi

    Mitokondriyal potansiyel kaybı (ΔΨm), mitokondride potansiyele bağlı bir şekilde biriken lipofilik katyonik JC-1 boyası kullanılarak akış sitometrik olarak analiz edildi ( El Gaafary ve diğerleri, 2015 ). 48 ve 72 saat boyunca Momundo özütü veya paklitaksel ile tedavi edilen hücreler, 37°C'de 20 dakika boyunca DMEM (4.5 g/l glukoz) içinde 10 ug/ml JC-1 boyası ile inkübe edildi.°C. ΔΨm kaybı, FlowJo yazılımı tarafından kırmızı/yeşil floresan yoğunluk oranında bir azalma olarak analiz edildi. Kaspaz 3/7 aktivasyonunun analizi için hücreler 1 saat 37°C'de inkübe edildi.°C, 100 μM florojenik kaspaz 3/7 substratı Z-DEVD-R110 varlığında. Floresan kaspaz 3/7 ürünü, akış sitometrisi ile tespit edildi. DNA fragmantasyonu in vitro olarak, hücre döngüsü analizi protokolü kullanılarak propidyum iyodür ile boyanmış, 48 saat boyunca işleme tabi tutulmuş MDA-MB-231 hücrelerinde akış sitometrisi ile analiz edildi.tümör ksenograftları

    Hayvan deneyleri, ilgili makamlar tarafından onaylanmış ve izin verilmiş olup, uluslararası ve ulusal yönergelere göre yapılmıştır. 1 x 10 6 , MDA-MB-231 hücreleri, orta / matrigel içinde piliç chorioallantoic membran ı (CAM) üzerinde aşılandı (1: 1, h / h) 7 gün sonra gübreleme . Sonraki 3 gün, ksenograftlar topikal olarak 20 ul ekstrakt veya %0.5 DMSO ile tedavi edildi. Tümör biyolüminesansı , tedavinin 4. gününde IVIS in vivo Görüntüleme Sistemi (PerkinElmer, Waltham, MA) kullanılarak d- lusiferin (0.75 mg/ml, 10 ul/yumurta) uygulamasından 5 dakika sonra ölçülmüştür . Daha sonra tümörler toplandı, sabitlendi ve parafine gömüldü. İmmünohistokimyasal analiz için, 5 µm kesitler ile zıt boyama yapıldı.hematoksilen , eozin ve proliferasyon markeri Ki-67'ye (M7240, Dako, Glostrup, Danimarka) karşı antikorlar kullanılarak ayrıca analiz edildi. Apoptoz analizi için , in vivo DNA zincir kırıkları , üreticinin protokolüne (Roche) göre terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik ucu etiketlemesi (TUNEL) ile görselleştirildi . Görüntüler bir Axio Lab.A1 mikroskobu (Carl Zeiss, Göttingen, Almanya) ve bir Zeiss 2/3" CMOS kamera ile Progres Gryphax yazılımı (Carl Zeiss) kullanılarak kaydedildi. Tümör hacmi (mm 3 ), şu formül kullanılarak değerlendirildi: uzunluk (mm) x genişlik² (mm) x π/6.

    İçin ksenonaklinin farelerde, 0.5 x 10 6 , MDA-MB-231 içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler fosfat tamponlu tuzlu su ortotopikal yoldan implante edildi meme bezi 8-9 haftalık dişi NMRI- arasında Foxn1 nu / nu fareleri (Janvier, Le Genest-St.- Adası, Fransa). Ksenonakilden fareler (8 fare / grup) 8 gün sonra başlayarak tedavi edildi ip 100 mg kg -1 gün -1 Momundo HP-β-CD, 2 mg kg -1 hafta -1 doksorubisin ya da 1000 mg kg -1 gün -1çözücü (HP-β-CD) 3 hafta süreyle. Tümör hacimleri 0,5 x uzunluk x genişlik x kalınlık formülüne göre hesaplandı. Deney sonunda anestezi uygulanmış hayvanlardan kardiyak ponksiyon ile alınan kan, standart yöntemler kullanılarak hastanenin klinik kimya laboratuvarında karaciğer enzimlerinin varlığı açısından analiz edilmiştir .istatistiksel analiz

    Sonuçlar, en az üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM'si olarak ifade edilir. İki grup karşılaştırması durumunda, sonuçlar iki kuyruklu Student t testi ile analiz edildi . Tek yönlü varyans analizi kullanılarak çoklu grup analizi yapıldı, ardından SigmaPlot yazılımı kullanılarak Newman-Keuls post hoc testi yapıldı . Anlamlılık seviyeleri * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 olarak belirlendi.Sonuçlar

    Momundo Artemisia annua özütünün fraksiyonlanması ve kimyasal karakterizasyonu

    İki Artemisia annua özütü, Momundo'nun Momundo ve asetonitrilde çözünür fraksiyonu (Momundo-ACN) HPLC ile karakterize edildi ( Şekil 1 B). Ekstraktlar, (a) 6,7-dimetoksi-kumarin, (b) krizosplenol D, (c) kastisin, (d) arteannuin B ve (e) arteannüik asit ( Şekil 1 B) ana bileşenlerini içerir . Şekil 1 C, Momundo'ya kıyasla Momundo-ACN'de önemli ölçüde daha yüksek olan ekstrelerdeki tanımlanmış bileşiklerin miktarlarını gösterir. Artemisinin Momundo özütlerinde saptanamadı ( Şekil 1 D).Momundo Artemisia annua özleri, meme kanseri hücrelerinde hücre döngüsü durmasına neden olur

    Floresan mikroskobuyla yapılan morfolojik analiz , meme kanseri hücre tedavisinden sonraki 24 saat içinde, Artemisia annua özütlerinin, özellikle Momundo-ACN'nin, paklitaksel'e benzer şekilde , çok çekirdekli, çoğunlukla 4 N hücre oluşumunu indüklediğini gösterir ( Şekil 2 A). Bu zaman noktasında, Momundo özütü , apoptotik hücre sayısında yalnızca hafif bir artışla kanser hücrelerine toksisite göstermedi ( Şekil 2 A,C ve Kısa Veri makalesi). Hücre döngüsü analizi , paklitaksele benzer şekilde Artemisia annua özütü ile yapılan tedavinin tetraploid popülasyonlarını arttırdığını doğruladı.(4 N) MDA-MB-231 hücreleri ve hücre döngüsünün S-fazındakiler ( Şekil 2 B) ve poliploid (≥ 8 N) hücre sayısı, sonrasında sayısı daha da arttı. 48 saat ( Şekil 2C). S-fazı hücre popülasyonundaki artış, apoptozun ve 4 N hücre tarafından DNA içeriğinin kaybının bir sonucu olabilir .
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (1MB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şekil 2 . Momundo Artemisia annua özü, hücre döngüsü ilerlemesini engeller ve meme kanseri hücrelerinde sitokinez yetmezliğine neden olur . (A) MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri hücreleri, 24 saat boyunca Momundo (100 ug/ml), Momundo-ACN (30 ug/ml) veya paklitaksel (100 nM) ile tedavi edildi , anti-tubulin antikoru ile boyandı ve Hoechst 33342 ve mikroskobik olarak analiz edildi. Grafik, çok çekirdekli hücrelerin yüzdesini gösterir. (B) Hücreler, 48 saat boyunca 100 ug/ml ekstrakt veya paklitaksel (100 nM) ile işleme tabi tutuldu, propidium iyodür ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. (C) Momundo-ACN, poliploid oluşumunu indükler(≥ 8 N) hücreler. Hücreler (A)'daki gibi işlendi ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Veriler ortalama ± SEM, n  = 3, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001'dir.Momundo Artemisia annua özleri, tedaviye dirençli kanser hücre hatlarının canlılığını seçici olarak azaltır

    Artemisia annua özleri konsantrasyona ve zamana bağlı olarak MDA-MB-231 hücrelerinin canlılığını engeller. Momundo-ACN özü, MDA-MB-231 hücrelerine karşı önemli ölçüde daha yüksek sitotoksisite sergiledi ve bir IC ile canlılığını inhibe 50 18 ug / ml Momundo özü IC ile karşılaştırıldığında 50 > 100 ug / ml, 48 saat sonra ( Şek. 3 A). Bu nedenle, asetonitril ekstraksiyonu, lipofilik sitotoksik bileşiklerin zenginleşmesiyle sonuçlandı. Momundo-ACN özütü, benzer şekilde , belirli bir tümör dokusu için spesifiklik olmadığını ve her ikisinin de yaşayabilirliği olarak hormon reseptörlerinin ekspresyonuna bağlı olmadığını gösteren , çeşitli diğer tedaviye dirençli kanser hücre hatlarına karşı sitotoksikti .meme kanseri hücre dizileri , TNBC MDA-MB-231 ve MCF-7 etkilenmiştir. İnsan NSCLC A549 hücreleri, bir IC ile Momundo-ACN karşı en hassas olan 50androjenden bağımsız PC-3 prostat kanseri hücreleri, IC ile en dayanıklı olanlar olduğu, oysa 8 ug / ml50ug / ml (56Şek. 3B). Önemli olarak,Artemisia annuaözleri kanser hücrelerine karşı seçicilik gösterir, çünkü Momundo-ACN ≤ 30 µg/ml'de normal meme epitel hücrelerine ve PBMC'ye karşı hiçbir toksisite göstermezken, 30 µg/ml'deMDA-MB-231'in canlılığını inhibe etti. yaklaşık %72 (Şekil 3C). Ayrıca lenfosit proliferasyonu72 saat boyunca Momundo özütü ile muameleden etkilenmedi ( Şekil 3 D).
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (511KB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şekil 3 . Momundo Artemisia annua özleri, çeşitli kanser hücrelerinin canlılığını seçici olarak inhibe eder . (A) Momundo özleri, meme kanseri hücrelerinin MDA-MB-231, doksorubisin – pozitif kontrol canlılığını inhibe eder . (B) Momundo-ACN özütü, XTT ile analiz edildiği üzere çeşitli tedaviye dirençli kanser hücre dizileri için sitotoksiktir . NSCLC, küçük hücreli dışı akciğer kanseri. (C) Normal meme epitel hücreleri ve PBMC , Momundo-ACN'ye (48 saat) nispeten dirençlidir. (D) Lenfosit proliferasyonu Momundo özünden etkilenmez. Hücreler CFSE ile boyandı , ekstrakt ile işlendi, 72 saat boyunca CD3/CD28 antikorları ile aktive edildi ve akış sitometrisi ile analiz edildi.Siklosporin A (5 ug/ml) pozitif kontrol olarak görev yaptı. Tüm veriler ortalama ± SEM, n  = 3 - 5'tir .Momundo Artemisia annua özü , in vitro meme kanseri hücrelerinde apoptozu indükler

    Momundo Artemisia annua ekstrelerinin sitotoksisitesinin apoptoz indüksiyonundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için birkaç apoptotik parametre analiz edildi ( Okada ve Mak, 2004 ). Gerçekten de, Momundo veya Momundo-ACN özütü ile 48 saat tedavi edilen hipodiploid DNA içeriğine sahip hücrelerin sayısı önemli ölçüde arttı. Paklitaksel ile tedavi edilen hücrelerde hipodiploid apoptotik hücre popülasyonunda benzer bir artış gözlendi ( Şekil 4 A).
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (809KB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şekil 4 . Momundo Artemisia annua özleri , in vitro olarak apoptozu indükler . (A) MDA-MB-231 hücreleri 48 saat boyunca işleme tabi tutuldu, propidium iyodür ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Apoptotik hipodiploid hücrelerin yüzdesi gösterilmiştir. (B) Hücreler, (A)'daki gibi 48 veya 72 saat işlendi, JC-1 ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Depolarize mitokondriyal membranlı hücreler (ΔΨ m ) gösterilmiştir. (C) Hücreler 48 saat süreyle işleme tabi tutuldu, florojenik kaspaz-3 substratı Z-DEVD-R110 ile inkübe edildi ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Veriler ortalama ± SEM, n  = 3-4, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
    Mitokondri, proapoptotik proteinleri sitoplazma aktive eden kaspaz 3'e salarak apoptozu teşvik eder ( Okada ve Mak, 2004 ). Artemisia annua ile indüklenen apoptozda içsel mitokondriyal yolun dahil olduğunu göstermek için mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨ m ) analiz edildi. Meme kanseri hücrelerinin Momundo özü veya paklitaksel ile tedavisi, mitokondriyal membran potansiyeli azaltılmış hücrelerin yüzdesini önemli ölçüde artırarak, mitokondriyal membran geçirgenliğini doğrulayarak sırasıyla %4.0'dan % 18.1'e ve %43.4'e yükseltti ( Şekil 4B). Bu verilerle uyumlu olarak, Momundo özütü ayrıca Artemisia annua özütü tarafından içsel apoptozun indüklendiğini doğrulayan kaspaz 3 aktivasyonunu da indükledi ( Şekil 4C). Bununla birlikte, kanser hücrelerinin bir kaspaz 8 inhibitörü olan IETD ile ön tedavisi , ekstre toksisitesini azalttığı, ancak yalnızca Momundo-ACN ekstresinin en yüksek konsantrasyonunda (50 µg/ml) olduğundan, dış yolun aktivasyonu tamamen dışlanamaz ( Kısa makaledeki veriler). Kaspaz 3'ün, kaspaz 8'e kıyasla çok daha düşük etkinliğe sahip olmasına rağmen ( Pop ve Salvesen, 2009 ) IETD'yi de parçalayabildiğini ve dolayısıyla IETD tarafından da inhibe edilebileceğini belirtmekte fayda var .Artemisia annua özleri, CAM üzerinde yetiştirilen meme kanseri ksenograftlarının büyümesini engeller

    CAM üzerinde büyütülen MDA-MB-231 meme kanseri ksenograftları ( Syrovets ve diğerleri, 2005 ) , Momundo ekstrelerinin in vivo antitümör aktivitesini doğrulamak için kullanıldı . Tedavi xenografts Momundo ve Momundo-ACN ile bağlı bir doz, tümör hacminin (indirgenmiş Şek. 5 A). Tümörlerin immünohistokimyasal analizi, Artemisia annua özleri tarafından kanser hücresi çoğalmasının inhibisyonunu ortaya çıkardı . Böylece, Momundo veya Momundo-ACN ile tedavi, çoğalma işaretçisi Ki-67'nin ifadesini önemli ölçüde azalttı ( Şekil 5 B,C). Ayrıca, Momundo Artemisia annuaözü , in vivo olarak DNA iplikçik kırılmalarının ve apoptozun indüklendiğini gösteren apoptotik TUNEL pozitif hücrelerin sayısını etkili bir şekilde arttırdı ( Şekil 5 D). Özellikle tavuk embriyosunda açık sistemik toksisite gözlemlenmemiştir.
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (2MB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şek. 5 . Artemisia annua özleri, büyümeyi inhibe eder ve in vivo meme kanseri ksenograftlarının apoptozunu indükler . Koryoallantoik civciv zarları (CAM) üzerinde büyütülen MDA-MB-231 ksenograftları , birbirini izleyen 3 gün boyunca her iki ekstreden de 20 ul ile muamele edildi. 4. günde, ksenograftlar yaşam görüntüleme ve immünohistokimyasal olarak analiz edildi. Doksorubisin (1 µM) – pozitif kontrol. (A) Hematoksilen ve eozin boyama (1. sıra), ekstraksiyondan sonra tümör görüntüleri (2. sıra), lusiferin ilavesinden sonra yumurtadaki tümörlerin biyolüminesans görüntülemesi(3. sıra), proliferasyon markeri Ki-67 (4. sıra, kırmızı-kahverengi nükleer boya, orijinal büyütme 200x). (B) Grafikler ortalama tümör hacimlerini gösterir. (C) Çoğalan Ki67 + hücrelerinin miktar tayini . (D) Momundo özü, meme kanseri ksenogreftlerinde apoptozu indükler. TUNEL + hücrelerinin temsili resimleri ve miktar tayini . Tüm veriler, n  ≥ 5 tümör/grubun ortalama ± SEM'si, Kruskal-Wallis testi ve Dunn'ın post-hoc çoklu grup testi veya 2 grup için Mann-Whitney sıralama toplamı testidir , * p < 0.05, ** p < 0.01.Momundo özü ile tedavi, farelerde insan meme kanseri ksenograftlarının büyümesini engeller

    Ek olarak, Momundo özütünün antikanser aktivitesi, farelerde ortotopik bir meme kanseri modelinde analiz edildi. Hayvanların 3 hafta boyunca Momundo özü ile günlük tedavisi, meme kanseri ksenogreftlerinin tümör büyümesini standart kemoterapötik doksorubisin ile benzer ölçüde geciktirdi ( Şekil 6 A). Momundo özünden farklı olarak yüksek toksisitesi nedeniyle doksorubisin haftada bir kez uygulandı. Buna göre, doksorubisin ile tedavi edilen farelerde vücut ağırlığı azalırken, Artemisia annua özütü ile tedavi edilen hayvanlar vücut ağırlığında hafif bir artış bile gösterdi ( Şekil 6B ). Ek olarak, doksorubisin, önemli ölçüde artan AST ve ALT karaciğer enzimi ile kanıtlandığı gibi hepatik toksisite sergilemiştir.plazma seviyeleri. Bu parametreler Momundo özütü ile tedavi edilen farelerde önemli ölçüde daha düşüktü ve bu da Momundo Artemisia annua özütünün daha düşük sistemik toksisitesi olduğunu düşündürdü ( Şekil 6 C).
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (258KB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şekil 6 . Artemisia annua özü Momundo , farelerde in vivo olarak ortotopik meme kanseri ksenograftlarının büyümesini engeller . 8 günlük ortotopik MDA-MB-231 ksenograftları için önceden oluşturulmuş fareler, günlük ip olarak tedavi edildi . 3 ardışık hafta boyunca 100 mg kg- 1 gün- 1 Momundo özütü veya siklodekstrin çözücü ile veya haftada bir kez 2 mg kg- 1 hafta -1 doksorubisin ile . (A) Tedavi başlangıcında ölçülen ortalama tümör hacmine normalize tümör büyümesi. (B) Fare vücut ağırlığı. (C) Momundo düşük karaciğer toksisitesi sergiler. Veriler, n'nin ortalama ± SEM'idir  grup başına  = 8 (A, B) ve n = 4 (C) fare; , Kruskal-Wallis ve Dunn post-hoc testi (A), Newman-Keuls testi (B) * p <0.05   vs , kontrol ve # p <0.05  vs , doksorubisin.Momundo Artemisia annua özü içeriği meme kanseri hücreleri için sitotoksiktir.

    Artemisia annua özütünün ana bileşenleri, arteannuin B, castisin, chrysosplenol D, arteannuic asit ve 6,7-dimetoksikumarin olarak tanımlandı ( Şekil 1 A). Arteannüik asit ve 6,7-dimetoksikumarin tarafından kanser hücresi yaşayabilirliğinde herhangi bir azalma indüklenmezken, arteannuin B, castisin ve chrysosplenol D, MDA-MB-231 hücre canlılığını zaten 24 saat içinde güçlü bir şekilde inhibe etti ( Şekil 7 ). Bu sonuçlar, Momundo Artemisia annua özütünün artemisinin içermemesine rağmen , TNBC hücrelerine karşı güçlü sitotoksik aktiviteye sahip ek doğal bileşikler içerdiğini göstermektedir.
    1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (196KB)
    2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

    Şek. 7 . Momundo özünden elde edilen saflaştırılmış bileşikler, meme kanseri hücrelerinin canlılığını azaltır . MDA-MB-231 hücreleri 24 saat boyunca işleme tabi tutuldu ve XTT ile analiz edildi, n  = 3 - 5.Tartışma

    Bitkisel müstahzarlar olarak pazarlanan Artemisia annua özleri, farmasötik içerikleri ve terapötik etkinlikleri yeterince çalışılmamış olmasına rağmen, genellikle kötü huylu hastalıklardan muzdarip kişiler tarafından alınır (Alsanad ve diğerleri, 2016;Michaelsen ve diğerleri, 2015). Bu çalışmada, 1), özelliği bir parçalara sahipArtemisia annua, 2) özü sergilediğini göstermiştir bitkisel preparasyon olarak pazarlanan özü anti-kanser aktivitesi in vitrovein vivo olarakaktif bileşiklerini tanımlanır) ve 3Artemisia annuayanında artemisinin , burada kudreti potansiyel olarak daha fazla araştırmaya değerantikanser ajanlar .

    Artemisia annua özütünün analitik karakterizasyonu için , 0,2 ng/mg özüt saptama limiti ile artemisinin saptanmasını sağlayan oldukça hassas bir HPLC-MS/MS yöntemi geliştirildi. İlginç bir şekilde, yüksek analitik duyarlılığa rağmen Momundo preparasyonunda artemisinin tespit edemedik. Bununla birlikte, Momundo özütü, ekstraktın araştırmaya değer diğer biyolojik olarak aktif bileşikleri içerdiğini gösteren antikanser etkinliği gösterdi. Bir Momundo kapsülünün içeriği ACN ile özütlendiğinde, elde edilen kuru özüt (Momundo-ACN) , DMSO'da doğrudan çözünen Momundo kapsül içeriğine kıyasla meme kanseri hücrelerine karşı daha yüksek sitotoksisite sergilemiştir.. Bu, Artemisia annuaözünde lipofilik sitotoksik bileşenlerin varlığına işaret etti . Bu sonuçlar, daha lipofilik metilen klorür ekstraktlarının HeLa kanser hücrelerine karşı daha yüksek polariteye sahip bileşenler içeren metanolik ekstraktlardan daha sitotoksikolduğunu gösteren bir çalışma ile tutarlıdır(Efferth ve diğerleri, 2011).

    Önemli olarak, Momundo-ACN Artemisia annua özütü, farklı dokulardan elde edilen çeşitli tedaviye dirençli kanser hücre dizileri için sitotoksiktir , ancak farklı hassasiyete sahiptir. Kanser hücre hatlarının ekstraktlara farklı tepkileri , ekstrakt tarafından aktive edilen apoptotik sinyal yolundaki varyasyonlardan kaynaklanıyor olabilir . Bu nedenle, MCF-7 hücreleri, birçok kemoterapötik ajana karşı hücre hattı direncinden sorumlu tutulan kaspaz 3 eksikliğidir ( Yang ve diğerleri, 2001 ). Benzer şekilde, MCF-7 hücreleri daha yüksek bir IC sergiledi 50 değeri Artemisia annua kaspaz 3 eksprese, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücreleri ile karşılaştırıldığında özü.

    Özellikle, normal meme epitel hücrelerinin yanı sıra PBMC'lerin canlılığı, normal hücrelere kıyasla kanser hücrelerine karşı farklı sitotoksisite gösteren kanser hücrelerinin canlılığını güçlü bir şekilde azaltan konsantrasyonlarda etkilenmedi. Uyarılmamış PBMC'ler çoğalmayan hücrelerdir ve bu onların Artemisia annua özüne karşı dirençlerini açıklayabilir . Bununla birlikte, çoğalan lenfositler, kanser hücrelerinde hücre döngüsü ilerlemesini açıkça hedefleyen Artemisia annua özütü ile tedaviye de dirençliydi . Ekstre ile tedavi edilen farelerin , doksorubisin ile tedavi edilenlere kıyasla kilo kaybı ve hepatotoksisiteden muzdarip olmadığını da belirtmekte fayda var.. Bu, Momundo'nun bariz bir potansiyel faydasıdır, çünkü tümör hastaları sıklıkla kaşeksiden ciddi şekilde etkilenir .

    Bu bulgular bizi, artemisinin yanında potansiyel antikanser bileşenlerini belirlemek amacıyla Momundo Artemisia annua özünü analiz etmeye ve parçalara ayırmaya teşvik etti .

    Sürdürülen proliferatif sinyalleşme ve düzensiz hücre döngüsü kontrolü , çoğu neoplazinin ortak özellikleridir ( Hanahan ve Weinberg, 2011 ). Momundo özü tedavisi , meme kanseri hücrelerinde konsantrasyona bağlı hücre döngüsü bozulmalarını ve sitokinez yetmezliğini ( Lens ve Medema, 2019 ) indükledi . Doğrudan DNA ile etkileşime giren kuersetin gibi flavonoidler için de benzer etkiler tarif edilmiştir ( Srivastava ve diğerleri, 2016 ). Quercetin, özünde oldukça yüksek konsantrasyonlarda tanımladığımız chrysosplenol D ve castisinin yapısal olarak ilişkili bir bileşiğidir. Momundo Artemisia annua'nın diğer bileşenleriözü ayrıca, paklitaksele benzer şekilde , anormal mitoz ve çok çekirdekli hücrelerin birikmesine yol açan mikrotübül dinamiklerini etkileyebilir ( de Leeuw ve diğerleri, 2015 ; Morris ve Fornier, 2008 ).

    Giden ilaçlar apoptoz apoptotik hücrelerin etkin bir bağışıklık hücreleri tarafından kaldırılır gibi kanser tedavisi için özellikle ilgi çekici olan , in vivo ( Wong 2011 ). Mevcut veriler, meme kanseri hücrelerinin Momundo Artemisia annua özütü ile tedavisinin , mitokondriyal membran potansiyeli , kaspaz 3 aktivasyonu ve DNA parçalanması ile tipik apoptoz belirtilerini indüklediğini ortaya koymaktadır . Ayrıca, ksenograft modellerinin Momundo özü ile tedavisi, in vivo olarak apoptoz indüksiyonunu gösterdi . Bu etkiler açıkça Artemisia annua'nın iyi bilinen artemisinin yanı sıra terapötik potansiyele sahip aktif maddeler içerir.

    Momundo-ACN özütünün fraksiyonlanması, beş ana bileşenin tanımlanmasını sağladı. Bunlardan üçü, arteannuin B, castisin ve chrysosplenol D, ekstraktın tümör büyümesi üzerindeki inhibitör etkinliğine sinerjik olarak katkıda bulunabilir. Flavonoidler chrysosplenol D ve kastisinin MDA-MB-231 hücrelerine karşı sitotoksisitesi, yapısal olarak ilişkili flavonoid kersetin için bildirilenden bile daha yüksekti ( Chien ve diğerleri, 2009 ). Bunun nedeni, daha lipofilik bir moleküle yol açan metoksillenmiş flavonol yapısı ve hücre zarlarından daha iyi nüfuz etme kabiliyeti olabilir.Çözüm

    Bu çalışma bir kanıt sağlar antikanser aktivitesi bir ait Artemisia annua bir olarak pazarlanan özü bitkisel preparat . Sonuçlar birlikte, Artemisia annua türevli bileşiklerin yeni anlayışlarını , bunların antikanser tedavisindeki potansiyel etkinliklerini ortaya koyuyor ve artemisinin'den farklı, yüksek oranda metastatik üçlü negatif insan meme kanseri hücrelerine karşı aktiviteye sahip bileşikleri ortaya çıkarıyor . Ek olarak, çalışma, bir bitkisel preparatta terapötik olarak aktif bileşikler için kanıt sağlar. Bu bulgular, terapötik amaçlar için bu bileşiklerin daha fazla araştırılmasını haklı çıkarmaktadır.Etik standartlara uygunluk

    Çıplak farelerle yapılan deneyler , Baden-Württemberg Eyaleti Hayvan Refahı ve Koruma Dairesi tarafından onaylanmıştır (referans numarası 1408). İnsan kanının toplanması ve periferik kan mononükleer hücrelerinin analizi , Üniversitenin Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası 177/18). Gönüllüler çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.Teşekkür

    Bu çalışma, Baden-Württemberg Eyaleti Bilim, Araştırma ve Sanat Bakanlığı Tamamlayıcı ve Bütünleştirici Tıp Akademik Merkezi (AZKİM) tarafından desteklenmiştir . Uzman teknik yardım için Felicitas Genze ve Eva Winkler'a teşekkür ederiz.Çıkar çatışması

    Yazarlar, yayınla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını ve sonucu etkileyebilecek herhangi bir finansal destek olmadığını belirtmişlerdir.Ek . tamamlayıcı malzemeler

    İndir : Word belgesini indirin (412KB)

    Ek Materyal 2: Deneylerle ilgili ek bilgilerReferanslar

    Alsanad ve diğerleri, 2016 SM Alsanad , RL Howard , EM Williamson
    Kanser hastaları tarafından kullanılan bitki-ilaç kombinasyonlarının etkisinin değerlendirilmesi
    BMC Tamamlayıcı Alter Med , 16 ( 2016 ) , s. 393
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Atanasov ve diğerleri, 2015 AG Atanasov , B. Waltenberger , EM Pferschy-Wenzig , T. Linder , C. Wawrosch , P. Uhrin , V. Temml , L. Wang , S. Schwaiger , EH Heiss , JM Rollinger , D. Schuster , JM Breuss , V . Bochkov , MD Mihovilovic , B. Kopp , R. Bauer, VM Dirsch , H. Stuppner
    Farmakolojik olarak aktif bitki kaynaklı doğal ürünlerin keşfi ve yeniden tedariği: bir inceleme
    Biotechnol Adv , 33 ( 2015 ) , s. 1582 - 1614
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Breuer ve Efferth, 2014 E. Breuer , T. Efferth
    Artemisia annua ile demir yüklü veteriner sarkomunun tedavisi
    Nat Prod Bioprospect , 4 ( 2014 ) , s. 113 - 118
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Chien ve diğerleri, 2009 SY Chien , YC Wu , JG Chung , JS Yang , HF Lu , MF Tsou , WG Wood , SJ Kuo , DR Chen
    Quercetin kaynaklı apoptoz, insan meme kanseri MDA-MB-231 hücrelerinde mitokondriyal ve kaspaz-3'e bağlı yolaklar yoluyla etki eder
    Hum Exp Toxicol , 28 ( 2009 ) , s. 493 - 503
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik de Leeuw ve diğerleri, 2015 R. de Leeuw , LD Berman-Booty , MJ Schiewer , SJ Ciment , RB Den , AP Dicker , WK Kelly , EJ Trabulsi , CD Lallas , LG Gomella , KE Knudsen
    Yeni nesil taksanların yeni eylemleri, prostat kanserinin ileri evrelerine fayda sağlıyor
    Clin Cancer Res , 21 ( 2015 ) , s. 795 - 807
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Eferth, 2017 T. Efferth
    Antik bitkiden modern ilaca: Kanser tedavisi için Artemisia annua ve artemisinin
    Semin Cancer Biol , 46 ( 2017 ) , s. 65 - 83
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Efferth ve diğerleri, 2011 T. Efferth , F. Herrmann , A. Tahrani , M. Wink
    Artemisia annua L.'den türetilen ikincil metabolitlerin kanser hücrelerine karşı sitotoksik aktivitesi , belirlenmiş aktif bileşen artemisinin ile karşılaştırıldığında
    Phytomedicine , 18 ( 2011 ) , s. 959 - 969
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik El Gaafary ve diğerleri, 2015 M. El Gaafary , B. Büchele , T. Syrovets , S. Agnolet , B. Schneider , CQ Schmidt , T. Simmet
    Bir a-asetoksi-tirukallik asit izomeri, Akt/mTOR sinyalini inhibe eder ve prostat kanseri hücrelerinde oksidatif stresi indükler
    J Pharmacol Exp Ther , 352 ( 2015 ) , s. 33 - 42
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik El Gaafary ve diğerleri, 2017 M. El Gaafary , SM Ezzat , AM El Sayed , OM Sabry , S. Hafner , S. Lang , M. Schmiech , T. Syrovets , T. Simmet
    Acovenosid A, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinde mitotik felaketi ve ardından apoptozu indükler
    J Nat Prod , 80 ( 2017 ) , s. 3203 - 3210
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Ferreira ve diğerleri, 2010 JF Ferreira , DL Luthria , T. Sasaki , A. Heyerick
    Artemisia annua L.'den antioksidanlar olarak flavonoidler ve sıtma ve kansere karşı artemisinin ile potansiyel sinerjileri
    Moleküller , 15 ( 2010 ) , s. 3135 - 3170
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Hanahan ve Weinberg, 2011 D. Hanahan , RA Weinberg
    Kanserin ayırt edici özellikleri: yeni nesil
    Hücre , 144 ( 2011 ) , s. 646 - 674
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Koehn ve Carter, 2005 FE Koehn , GT Carter
    İlaç keşfinde doğal ürünlerin gelişen rolü
    Nat Rev Drug Discov , 4 ( 2005 ) , s. 206 - 220
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Lens ve Medema, 2019 SMA Lens , RH Medema
    Sitokinez kusurları ve kanser
    Nat Rev Cancer , 19 ( 2019 ) , s. 32 - 45
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Li ve diğerleri, 2012 X. Li , T. Syrovets , T. Simmet
    Serin proteaz plazmin, CC-kemokin ligandı 20'nin dendritik hücrelerde Akt/NF-κB'ye bağlı yollar yoluyla ekspresyonunu tetikler
    J Biomed Biotechnol , 2012 ( 2012 ) , Madde 186710
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Michaelsen ve diğerleri, 2015 FW Michaelsen , ME Saeed , J. Schwarzkopf , T. Efferth
    Aktivitesi Artemisia annua prostat kanserinde ve artemisinin türevleri,
    Phytomedicine , 22 ( 2015 ) , s. 1223 - 1231
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Morad ve diğerleri, 2011 SA Morad , C. Schmidt , B. Büchele , B. Schneider , M. Wenzler , T. Syrovets , T. Simmet
    (8R)-3β,8-dihidroksipolipoda-13E,17E,21-trien, tedaviye dirençli prostat kanseri hücrelerinde hücre döngüsü durmasını ve apoptozu indükler
    J Nat Prod , 74 ( 2011 ) , s. 1731 - 1736
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Morris ve Fornier, 2008 PG Morris , MN Fornier
    Mikrotübül aktif ajanlar: taksan sınırının ötesinde
    Clin Cancer Res , 14 ( 2008 ) , s. 7167 - 7172
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Nosrati ve diğerleri, 2018 H. Nosrati , N. Sefidi , A. Sharafi , H. Danafar , H. Kheiri Manjili
    Kurkumin-antikanser ilacı için biyouyumlu taşıyıcılar olarak Bovine Serum Albumin (BSA) kaplı demir oksit manyetik nanopartiküller
    Bioorg Chem , 76 ( 2018 ) , s. 501 - 509
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Okada ve Mak, 2004 H. Okada , TW Mak
    Tümör hücrelerinde apoptotik ve apoptotik olmayan ölüm yolları
    Nat Rev Cancer , 4 ( 2004 ) , s. 592 - 603
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Pop ve Salvesen, 2009 C. Pop , GS Salvesen
    İnsan kaspazları: aktivasyon, özgüllük ve düzenleme
    J Biol Chem , 284 ( 2009 tarihinden bu ) , s. 21777 - 21781
    MaddePDF İndirÇapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Slezakova ve Ruda-Kucerova, 2017 S. Slezakova , J. Ruda-Kucerova
    Artemisinin ve türevlerinin antikanser aktivitesi
    Anticancer Res , 37 ( 2017 ) , s. 5995 - 6003
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Srivastava ve diğerleri, 2016 S. Srivastava , RR Somasagara , M. hegde , M. Nishana , SK Tadi , M. Srivastava , B. Choudhary , SC Raghavan
    Doğal bir flavonoid olan Quercetin, DNA ile etkileşime girer, hücre döngüsünü durdurur ve apoptozun mitokondriyal yolunu aktive ederek tümör gerilemesine neden olur.
    Sci Rep , 6 ( 2016 ) , s. 24049
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Steinborn ve diğerleri, 2018 C. Steinborn , O. Potterat , U. Meyer , R. Trittler , S. Stadlbauer , R. Huber , C. Gründemann
    Equisetum arvense'nin in vitro anti-inflamatuar etkilerine yalnızca silika aracılık etmez.
    Planta Med , 84 ( 2018 ) , s. 519 - 526
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Syrovets ve diğerleri, 2005 T. Syrovets , JE Gschwend , B. Büchele , Y. Laumonnier , W. Zugmaier , F. Genze , T. Simmet
    Asetil-boswellik asitler tarafından IkappaB kinaz aktivitesinin inhibisyonu, androjenden bağımsız PC-3 prostat kanseri hücrelerinde in vitro ve in vivo apoptozu teşvik eder
    J Biol Chem , 280 ( 2005 ) , s. 6170 - 6180
    MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Wang ve diğerleri, 2009 H. Wang , C. Ma , L. Ma , Z. Du , H. Wang , H. Ye , G. Li , B. Liu , G. Xu
    Artemisia annua'nın iki genotipinin ikincil metabolik profili ve artemisinin biyosentezi
    Planta Med , 75 ( 2009 ) , s. 1625 - 1633
    Görünüm PDF
    Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Wong, 2011 RS Wong
    Kanserde apoptoz: patogenezden tedaviye
    J Exp Clin Cancer Res , 30 ( 2011 ) , s. 87
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Yang ve diğerleri, 2001 X.-H. Yang , TL Sladek , X. Liu , BR Butler , CJ Froelich , AD Thor
    Kaspaz 3'ün yeniden yapılandırılması, MCF-7 meme kanseri hücrelerini doksorubisin ve etoposid kaynaklı apoptoza duyarlı hale getirir
    Cancer Res , 61 ( 2001 ) , s. 348 - 354
    Görünüm PDF
    Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik

  • #2
    ANTİKANSER AKTİVİTE ARAŞTIRMALARINDA ARTEMISIA ANNUA L. BİTKİSİNİN ÖNEMİ
    Erkan YALÇINKAYA1* , Serdar ÖZGÜÇ2 , Ahmet AYDINALP3 , Ulvi ZEYBEK4 1 Talaytepe Aile Sağlığı Merkezi, Merkez-Diyarbakır 2 İzmir Tabip Odası, Alsancak-İzmir 3 Diyarbakır Çocuk Hastalıkları Hastanesi, Pediatri Bölümü, Merkez-Diyarbakır 4 Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Botanik Anabilim Dalı, Bornova-İzmir

    ÖZ
    Kanserin dünya çapında ölüm nedenlerinin başında geldiği bilinmektedir. Normal hücre üzerine toksisite göstermeyen, sadece kanser hücresini selektif olarak yok eden ya da gelişimini durduran ilaçları geliştirmek zordur. Daha aktif, daha selektif ve daha az toksik antikanser ilaçlarını geliştirmek kanser araştırmalarının temel hedefleri olmuştur. Artemisia annua L., Geleneksel Çin Tıbbı’nda kullanılan bir tıbbi bitkidir. Bitki, plazmodyum için yoğun olarak araştırılmış ve bu alandaki kullanımı dünya geneline yayılmıştır. Bitkinin aktif bileşenlerinden olan artemisinin, antiviral, antienflamatuar, antiparaziter, antiallerjik, antifibrotik, antiaritmik, immunmodulatör, antitümör ve sitotoksik etkilidir. Bu çalışmanın amacı A. annua bitkisinin aktif maddelerinin ve kanser üzerindeki etkilerinin derlenmesidir

    Anahtar kelimeler: antikanser aktivite; Artemisia annua L.; artemisinin; kanser

    GİRİŞ
    Kanser, ölüm nedenleri arasında dünyada ilk sıralarda yer alan kompleks bir hastalık olma özelliğini sürdürmektedir. Kanser için ilaç geliştirme süreçleri ve kanserin etyopatogenezi üzerine süren araştırmalar birçok ilaç molekülünün kullanımına olanak sağlamıştır. Ancak bu moleküllerin bir kısmının yan etkilerinin fazla oluşu, bir kısmının sadece kanserin oluşmasında rol oynayan birden fazla yolaktan sadece birine etki etmesinden dolayı klasik kemoterapi ilaçları kanser üzerinde istenen başarıya ulaşamamıştır. Bunun üzerine, hücresel sinyal yolaklarına çok hedefli olarak etki eden bitkisel kaynaklı moleküller ve analogları üstüne de çalışmalar yoğunlaşmıştır [1]. Artemisia annua L., Asteraceae familyasının Anthemideae Tribus’u altında yer alır. İnvolukrumu oluşturan braktelerin kenarları sarımsıdır, papus yoktur. Artemisia cinsi, 200-400 arasında türü içeren genellikle kuzey ve güney yarımkürede kuru ya da yarı kurak iklimlerde yetişen, sert otsu ya da çalımsı ve tek yıllık olan bitkilerdir. Kurutulmuş yapraklarındaki aktif moleküllerden artemisinin oranı ≤ 0.01 - > 1.0 % dır [2]. Yeni hibrit türlerde bu oran %2 ye kadar çıkarılmıştır [3]. A. annua tıbbi bitkisinin geleneksel kullanımı MÖ 200 yıllarına kadar dayanır. Geleneksel Çin Tıbbında malarya ve yüksek ateşte kullanılmaktadır. Vietnam savaşında Kuzey Vietnam askerleri yaygın olarak malaryaya yakalanmaktaydı. Bu durum Çin hükümetini daha iyi ve etkili antimalaryal ilaçlar geliştirmeye yöneltmiştir. Dr. Tu Youyou ve ekibinin liderliğiyle başlatılan proje Çin’de bulunan tıbbi bitkilerin yaklaşık on bininin incelenip bunların arasında seçilenlerin analizleri yapılmış ve A. annua üzerine yoğunlaşılmıştır. Kullanılan ekstraksiyon yöntemleri sonucunda elde edilen ekstrelerin toksik etkileri olduğu görülmüştür. Bunun üzerine tekrar etnobotanik araştırmalar yapılmış ve bir arkeolojik kazı esnasında Ge Hong tarafından (MS 281-340) yazılan bir kitap bulunmuştur.

    Bu kitapta A. annua’nın geçmeyen ateşli hastalıklarda kullanıldığı ve kullanımının taze bitki suyu şeklinde olduğu öğrenildikten sonra, laboratuvarda Dr. Tu Youyou aktif moleküllerden biri olan antimalaryal etkin madde artemisinin ve türevlerini 1972 yılında izole etmiş [4] ve bu çalışmaları 2015 Nobel ödülünü almasına neden olmuştur. A. annua’nın ana bileşeninin, seskiterpenlakton yapısındaki artemisinindir. Artemisininin yarı sentetik türevleri olan dihidroartemisin, artemether, artesunat, artemison önde gelen antimalaryal ilaçların içeriğinde bulunurlar [5]. Artemisinin ve türevlerinin malarya tedavisinde kullanımının etkinliği ve düşük toksititesi kanıtlandıktan sonra diğer terapötik olabilecek antiparaziter, antiviral, antifungal, antiastmatik, antienflamatuar ve potansiyel antikanser fonksiyonları üzerine çalışmalar yapılmaya başlanmıştır [6, 7]. Artemisininin türevleri hücre içinde ve parazit içinde aktive olan öncül moleküllerdir [8, 9]. Plazmodyumun mitokondri ve hücre membranındaki depolarizasyon mekanizmasının azalmasında artemisinin türevleri ve endoperoksit bağı etkili bulunmuş ve bu yolla Malarya tedavisinde ilk kullanılabilecek ajanlar arasına girmiştir [10]. Yapısındaki fonksiyonel grup olan endoperoksidin, hücre içinde yüksek reaktif olan karbon merkezli radikallere bağlandığı ve proteinlerin alkilasyonuna katılıp, reaktif oksijen bileşikleri oluşturarak hem antiparazitik hem de antikanser özelliklerinin oluşmasında hücre içi demirin önemli bir rol üstlendiği düşünülmektedir [11]. Demir, hücre büyümesi ve proliferasyonu için esansiyel bir elementtir bunun yanında; kanserleşme sürecinin başlamasına, tümör büyümesine ve metastaza neden olabilir [12]. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri, kolorektal kanser gibi bir dizi yaygın kanser türlerinde demirin kanser gelişimindeki etkisi gösterilmiştir [13,14]. Kanser hücreleri membranındaki Transferrin Reseptör 1 (TfR1) düzeylerinin yüksek olmasından dolayı serumdaki ferritinin hücre içine geçişi artar ve normal hücrelerden ayrımını yapabilecek bir parametre olarak da kullanılabilir. Bu aşamada Artemisinin, hücre dışında serumda transferrine kovalent bağ ile bağlanır ve ikisi birlikte hücre içine endositoz ile alınır [15, 16]. Artemisinin, demir bağı ile çok potent ve selektif olarak kanser hücre ölümü yapar. Artemisinin’in kanser hücre kültürlerindeki antiproliferatif etkisinin, demir ve ‘hem’ molekül ile olan ilişkisinden kaynaklandığı gösterilmiştir [17]. Moleküler olarak Artemisinin’in yapısında bulunan endoperoksit bağı ile, Fe+2’nin reaksiyona girmesinin muhtemel olduğu [18, 19] ve ferroptozisi (demir bağımlı hücre ölümü) indüklediği gösterilmiştir [20, 21]. Mevalonat yolağındaki glutatyonperoksidaz 4 enzim aktivitesinin azalmasından dolayı, lipidhidroperoksit oluşumu artar ve bu durum ferroptozise neden olmaktadır [22]. Bununla birlikte, transferrin membran reseptörü ile tümör profilerasyon markerı olan Ki-67 markerının korele olduğu rapor edilmiş [23] ve artemisinin’in transferrin konjugasyonu ile antikanser etikisi incelenmiştir [24] Kanser hücrelerine selektivitesinin yüksek olması nedeniyle, artemisinin ve türevlerinin anti kanser potansiyellerinden dolayı kanser araştırmalarında umut verici çalışmalar bulunmaktadır. [25] Artemisinin ile yapılan araştırmalarda kemoterapi ve radyoterapiye dirençli hücre kültürlerinde bile antikanser potansiyeli gösterilmiştir.

    A.annua ile yapılan antikanser araştırmalarda kısa dönem bikalutamid ve uzun dönem A.annua tabletlerinin metastatik prostat kanserinde gerilemeye neden olabileceği [26],Artesunatın metastatik renal hücreli kanser hücre kültürlerinde antimetastatik, antitümör ve antianjiogenik etki gösterdiği ve hücreleri sorafenib’e karşı duyarlılaştırdığı [27], in vivo pankreatik kanser zenograft modellerinde mitokondriyal membran potansiyelinin azalmasına ve tümörde gerilemeye neden olduğu [28], vasküler endotelyal büyüme faktörünü azaltıp kalpain-2 ekspresyonunu arttırarak gastrik kanserde tümör büyümesini durdurduğu [29], glioblastomada diğer kemoterapotikler ile kombine kullanılarak rekürrensi önleyebileceği [30], karaciğer kanserlerinde sitotoksik ve 5-florourasil ile sinerjistik etki gösterdiği [31], bitkinin hayvan deneylerinde sarkomalarda tam remisyon yapabileceği [32], kolorektal kanserlerde rekürrensi azaltabileceği [33], artemisinin siklin bağımlı kinaz 2 ve 4 reseptörlerini down regüle ederek endometrial kanser hücre kültürlerinde antiproliretaif etki gösterdiği [34], oral skuamöz kanserlerde apoptotik etki gösterdiği [35], uveal melanomada artesunatın futemustin ve dakarbazin ile beraber kullanılabileceği ve kanser gelişimini durdurabileceği [36], dihidroartemisinin akciğer kanser hücre kültürlerinde mRNA baskılanması ile apoptotik etki gösterdiği [37] bulunmuştur. Artemisinin ve türevlerinin kanser hücreleri üzerine sinerjistik etki gösterdiği diğer moleküller ile ilgili araştırmalarda D3, C vitamini [38], kurkumin [39], allisin, butirat [40] ve resveratrol [41] ile sinerjik etkileşime girdiği görülmüştür. Artemisinin türevlerinin kullanımının güvenli bulunmasına [42] rağmen, bazı çalışmalarda uzun dönemli kullanımlarda geçici infertilite [43] olabileceği de gösterilmiştir

    SONUÇ VE TARTIŞMA
    Etkili bir kanser ilacı için artemisinin ve türevleri, ilaç geliştirme süreçlerinde avantaj sağlayabilecek bir fitoterapötik olabilir. Toksik etkilerinin azlığı, selektivitesinin yüksekliği, geniş kanser hücre kültürlerinde ve canlı araştırmalarındaki bulunan etkisi, rezistans gelişme potansiyelinin azlığından dolayı ve en önemlisi malarya için hali hazırda üretilmiş ilaç olması ve yapılmış güvenirlilik araştırmaları Artemisia annua’nın gelecek kanser araştırmalarında avantajlı olmasını sağlamaktadır. A. annua’nın kanserde kullanımlarının daha bilimsel bir temele oturtmak için etki mekanizmalarının daha fazla anlaşılması ve daha fazla klinik araştırmalarla desteklenmesi gerekmektedir.

    Yorum yap


    • #3
      Doğal Bir Flavonoid olan Quercetin, DNA ile Etkileşime Giriyor, Hücre Döngüsünü Durduruyor ve Mitokondriyal Apoptoz Yolunu Aktive Ederek Tümör Gerilemesine Neden Oluyor


      Bilimsel Raporlar Ses 6 , Makale numarası: 24049 ( 2016 ) Bu makaleyi alıntılayınSoyut

      Doğal olarak oluşan bileşikler, kanser tedavisi ve önlenmesi için çekici adaylar olarak kabul edilir. Quercetin ve ellagic asit, çeşitli meyve ve sebzelerde bol miktarda bulunan doğal olarak oluşan flavonoidlerdir. Bu çalışmada, hayvan modellerinde ve kanser hücre dizilerinde kersetin ve ellagik asidin antitümör etkilerini kapsamlı bir şekilde değerlendiriyor ve karşılaştırıyoruz. Quercetin'in lösemik hücrelerde doza bağımlı bir şekilde sitotoksisiteyi indüklediğini, ellagik asidin ise sadece sınırlı toksisite gösterdiğini bulduk. Lösemik hücrelerin yanı sıra, kersetin meme kanseri hücrelerinde sitotoksisiteyi de indükledi, ancak normal hücreler üzerindeki etkisi sınırlıydı veya hiç olmadı. Ayrıca, kersetin, test edilen kanser hücrelerinde hücre döngüsü ilerlemesi sırasında S fazının durmasına neden oldu. Quercetin, farelerde ellagik asitten 3 kat daha düşük bir konsantrasyonda tümör gerilemesine neden oldu. Önemli olarak, kersetin uygulaması, tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla tümör taşıyan farelerde yaşam süresinde ~ 5 kat artışa yol açmıştır. Ayrıca, quercetin'in DNA ile doğrudan etkileşime girdiğini ve intrinsik yolu aktive ederek hem kanser hücre hatlarında hem de tümör dokularında apoptozu indükleyen mekanizmalardan biri olabileceğini bulduk. Bu nedenle, verilerimiz, kersetin'in kanser terapötiklerinde ve kombinasyon terapisinde kullanım potansiyeli açısından daha fazla araştırılabileceğini göstermektedir.Tanıtım

      Farklı hastalıklar arasında, kanser hala insanların hayatta kalması için en zararlı olarak kabul edilmektedir. Kemoterapi, kanseri tedavi etmek için en umut verici yöntem olarak kabul edilmektedir. Kansere karşı kemoterapi elli yıldan fazla bir süre önce tanıtılmış olmasına rağmen, kanserlerin çoğunda uygulaması hala çok sınırlıdır. İdeal olarak, bir kemoterapötik ilaç, neoplastik hücrelere özgü belirli bir reseptörü, proteini veya DNA'yı hedefleyerek kanser hücrelerini yok etmeli ve sitotoksik ve/veya sitostatik etkileri indükleyerek, komşu normal hücrelere en az ikincil hasar vererek tümör yükünü azaltmalıdır.

      Doğal olarak oluşan bileşikler, beklenen multimodal etkileri ve sınırlı toksisiteleri nedeniyle kanserin önlenmesi ve tedavisi için test edilecek en ilginç ajanlar olarak kabul edilir. Fitokimyasallar ayrıca hücre proliferasyonunu, apoptoz aktivasyonunu vb. düzenleyenler dahil olmak üzere hücreler içindeki sinyal yollarını da etkileyebilir. Ek olarak, doğal olarak oluşan bileşiklerin standart kemoterapötik ilaçlarla kombine rejimleri, katkı maddesi veya sinerjistik etkinlik sağlamada çok umut vericidir. Doğal olarak oluşan çeşitli bileşikler arasında, polifenollerin üzüm, çilek, ceviz, nar, elma vb. dahil olmak üzere çeşitli yenilebilir meyvelerde mevcut olduğu bilinmektedir. Bunların arasında flavonoidler, hemen hemen her yerde her yerde bulunan doğal, küçük moleküler ağırlıklı büyük bir gruptan oluşur. tüm meyve ve sebzeler.

      Polifenollerin farklı kanserlere karşı antikanserojenik özelliklere sahip olduğu bildirilmektedir. Polifenol içeren gıdaların kanser önleme ve tedavisindeki etkinliğini ele alan çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte, polifenollerin antikanser özelliklerinden sorumlu olan bileşenleri tanımlamak için yalnızca sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Benzer şekilde, bitkilerden saflaştırılan bu tür küçük moleküllü inhibitörlerin tümör hücrelerine etki ettiği mekanizma hakkında çok az şey bilinmektedir.

      Quercetin (3,3',4',5,7-pentahidroksi-flavon), meyve ve sebzelerde en bol bulunan flavonoidlerden biridir ( Ek Şekil 1 ). Antikanser ve antiinflamatuar etkiler gösterdiği gösterilmiştir 1 , 2 . Antiproliferatif doğası ve antihipertansif ve nörotropik aktiviteyle ilgisi nedeniyle, kimyasal olarak sentezlendi ve ticari olarak satıldı 3 , 4 , 5 . Antioksidan ve oksidatif özellikleri hakkında çelişkili raporlar var 6 , 7 , 8, daha fazla değerlendirmeye ihtiyaç duyan. Quercetin'in hücre döngüsü durmasını indükleme yeteneği, çelişkili bulgular bildirildiği için ek araştırmaları da garanti eder. Örneğin, kersetin tedavisinin lösemide G0/G1'de hücre döngüsü durmasına yol açabileceği görülmektedir 9 , 10 veya kolorektal karsinomda S fazı 11 veya meme karsinomu, lösemi ve özofagus adenokarsinom hücre hatlarında hücre döngüsünün G2/M fazları 12 , 13 , 14 . Ellagik asit ayrıca meyvelerde ve kabuklu yemişlerde bol miktarda bulunan fenolik bileşiklerden biridir ve hücre hareketliliğini ve hücre istilasını engellediği bildirilmektedir ( Ek Şekil 1 ) 15. G1 fazında hücre döngüsü durmasına neden olduğu ve 100 μM 16 konsantrasyonunda apoptozu indüklediği bilinmektedir .

      Quercetin, resveratrol 1 , 2-metoksiestradiol 17 , luteolin türevleri 18 , ellagik asit 2 gibi doğal olarak oluşan birçok bileşik ve ayrıca kemoterapide kullanılan sentetik ilaçlar, örneğin doksorubisin 19 , sisplatin 20 vb. ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Bazı durumlarda kombinasyon kersetin ile tedavi sinerjistik etkilere de neden oldu 1 , 17 , 21 .

      Çeşitli kanser hücre dizilerinde kersetin ve ellagik asidin sitotoksisitesini öne süren çeşitli çalışmalara rağmen, bu flavonoidlerin tümör gerilemesi sırasındaki etki mekanizması büyük ölçüde belirsizdir. Bu nedenle, bu çalışmada quercetinin antikanser özelliklerini sistematik bir şekilde ex vivo , in vitro ve in vivo kullanarak araştırdık.model sistemler. Kanser hücrelerinde ellagik asitten birkaç kat daha yüksek sitotoksisite seviyelerini indüklediğini bulduk. Quercetin ayrıca meme kanseri hücrelerinde lösemik hücreler dışında sitotoksisiteye neden oldu, ancak normal hücreler üzerindeki etkisi sınırlıydı veya hiç olmadı. Ayrıca, quercetin'in S fazı durmasını indüklediğini gösterdik; ancak, tespit edilebilir herhangi bir ROS üretimi gözlemleyemedik. Quercetin, farelerde ellagik asitten daha etkili bir şekilde tümör gerilemesine neden oldu ve hayatta kalmada ~ 5 kat artışa yol açtı. Quercetin, intrinsik yolu aktive ederek hem kanser hücre dizilerinde hem de tümör dokularında apoptozu indüklemiştir. Bu nedenle verilerimiz, kersetin'in hem geleneksel hem de kombinasyon terapisinde potansiyel bir kanser önleyici madde olarak daha da geliştirilebileceğini göstermektedir.Sonuçlar

      Quercetin kanser hücrelerinde sitotoksisiteyi indükler

      Kuersetin ve ellagik asidin sitotoksik etkisi, üç lösemik hücre hattında (CEM, K562 ve Nalm6), iki meme kanseri hücre hattında (T47D ve EAC) ve iki normal hücre hattında (293T ve MEF1) incelenmiştir. Hücreler artan konsantrasyonda quercetin ve ellagic asit (48 saat boyunca 10, 50, 100 ve 250 uM) ile muamele edildi ve sitotoksik etki, MTT veya tripan mavisi ve bazı durumlarda her ikisi ile değerlendirildi. Sonuçlar, kuersetin'in tüm lösemik hücre dizilerinde doza bağımlı bir şekilde sitotoksisiteyi indüklediğini, ellagik asidin ise sadece sınırlı hassasiyet sergilediğini gösterdi ( Şekil 1 ). Lösemik hücreler arasında, Nalm6, en düşük kersetin konsantrasyonunda (10 μM) bile hücre canlılığında azalma gösteren maksimum hassasiyet sergiledi. IC 50quercetin değerinin 48 saatte Nalm6, K562 ve CEM'de sırasıyla 20, 40 ve 55 μM olduğu tahmin edildi. Ellajik asit için IC 50 170,> 250, sırasıyla Nalm6, K562 ve CEM, 183 uM idi. Bu nedenle, sonuçlarımız, quercetin'in test edilen tüm kanser hücre dizilerinde önemli ölçüde daha yüksek toksisiteye neden olduğunu gösterdi. Şekil 1Şekil 1
      Lösemik hücre hatlarında kersetin ve ellagik asidin sitotoksik etkisinin belirlenmesi.

      Hücre canlılığı ve hücre proliferasyonu, sırasıyla CEM, K562 ve Nalm6 hücre hatları üzerinde MTT ve tripan mavisi tahlilleri ile belirlendi. Hücre çizgileri, 48 saat boyunca kersetin (QR) ( A ) veya ellagik asit (EA) ( B ) ile işlendi . DMSO ile muamele edilmiş hücreler, her iki durumda da araç kontrolü ('C' ile gösterilir) olarak görev yaptı. Kullanılan bileşik konsantrasyonları 10, 50, 100 ve 250 uM idi. 'ns' 'anlamlı değil' iken '*' anlamlılığı temsil eder (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001). Veriler, üç bağımsız tekrarın SEM'sini temsil eder.

      Tam boyutlu resim
      Quercetin, lösemik hücre dizilerinde daha yüksek toksisite sergilediği için, etkisi, MTT tahlili kullanılarak insan meme kanseri hücre dizisi T47D'de ayrıca değerlendirildi. Sonuçlar bir IC ile kersetin için sınırlı bir hassasiyet gösteren 50 T47D hücrelerinde 160 uM ( Suppl. Şek. 2A ). Kersetin fare göğüs kanser hücre hattı, EAC karşı test edildi İlginçtir ki, bu (IC çok daha yüksek hassasiyet göstermiştir 50 ellajik asit kullanıldığı zaman böyle bir etki gözlenmemiştir ise, 50 uM) ( Suppl. Şek. 2B ). Bununla birlikte, normal hücre hatları (293T ve MEF-1), MTT tahlili kullanılarak analiz edildiğinde, kersetin'in duyarsız olduğu bulundu ( Ek Şekil 2A).). Quercetin (20 ve 50 uM) ile muamele edilen Nalm6 hücrelerinin, Calcein-A/PI ile boyamanın ardından canlı ölü hücre analizi ile değerlendirilmesi, Nalm6 hücrelerinde kersetin tarafından indüklenen yüksek sitotoksisiteyi doğruladı ( Ek Şekil 3 ).

      Bu nedenle, sonuçlarımız, kersetin'in hem lösemik hem de meme kanseri hücre dizilerinde önemli toksisiteye neden olduğunu, ancak normal hücreler üzerindeki etkisinin minimum olduğunu göstermektedir. Quercetin, hücre döngüsü ilerlemesi sırasında S fazı durmasını ve ardından apoptozu indükler

      Nalm6 hücreleri, 8, 16 ve 24 saat boyunca kersetin (20 uM) ile muameleyi takiben akış sitometrik analizlerine tabi tutuldu. Sonuçlar, Nalm6 hücrelerinde 16 saatlik kersetin tedavisinin ardından belirgin bir S fazı durması gösterdi ( Şekil 2A,B ). Ayrıca, araç kontrolüne kıyasla Nalm6 hücreleri artan konsantrasyonlarda kersetin (48 saat boyunca 10, 50, 100, 250 μM) ile tedavi edildiğinde Sub G1 fazında apoptotik hücre popülasyonunda doza bağlı bir artış gözlendi ( Şekil 2C, D ). İlginç bir şekilde, S fazında hücre döngüsü durması sadece daha düşük zaman noktasında (16 saat) gözlemlenirken, 48 saatte Sub G1 popülasyonunda doza bağlı bir artış gözlemlendi ( Şekil 2C,D ). Bu nedenle, sonuçlar, kersetin'in kanser hücrelerinde S fazı durmasını ve ardından apoptozu indüklediğini göstermektedir. şekil 2şekil 2
      Nalm6 hücrelerinde quercetin'in hücre döngüsü ilerlemesi üzerindeki etkisi.

      ( A ) Nalm6 hücreleri (0.75 x 10 5 hücre / ml), 8, 16 ve 24 saat kuersetin (20 uM) ile 37 ° C'de inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından hücreler toplandı, sabitlendi ve propidium iyodür ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. ( B ) Hücre döngüsünün S fazındaki hücrelerin yüzdesini gösteren çubuk diyagram. ( C ) 48 saat boyunca artan konsantrasyonlarda (10, 50, 100, 250 uM) kersetin ile muamele edildikten sonra Nalm6 hücrelerinin hücre döngüsü dağılımı. Akış sitometrisi analizinden sonra elde edilen histogram gösterilir. ( D) Hücre döngüsünün her aşamasında hücre yüzdesini gösteren çubuk diyagramlar. C, tek başına hücreleri temsil ederken, VC, DMSO ile muamele edilmiş araç kontrolünü temsil eder. Her durumda M1 G1 fazını, M2 G2 fazını, M3 S fazını ve M4, Alt G1 fazını temsil eder. Hata çubukları, iki bağımsız tekrarın SEM'sini temsil eder ve '*' anlamlılığı gösterir, *P < 0.05.

      Tam boyutlu resim Quercetin, interkalasyon yoluyla DNA'ya bağlanır

      Quercetin'in DNA bağlama kabiliyeti, buzağı timusu (CT) DNA'sı ile inkübe edilerek ve ardından CD spektroskopisi ile test edildi. CT DNA tek başına incelendiğinde doğal bir B-DNA konformasyonu gözlenirken, DNA artan konsantrasyonlarda kersetin (1 saat süreyle 50, 100, 150 uM, RT) ile inkübe edildiğinde pikte negatif bir kayma gözlemlendi ( Şekil 3A ) bir interkalasyon faaliyeti önermektedir. Etidyum bromür ile boyanmış DNA, 275 nm'de pozitif bir kaymanın ve 248 nm'de bir negatif kaymanın gözlemlendiği bir pozitif kontrol görevi gördü ( Şekil 3A).). Jel mobilite kaydırma deneyi, pUC18 DNA'nın süper sarmal ve doğrusallaştırılmış (EcoRI ile sindirilmiş) formu kullanılarak yapıldı. Artan konsantrasyonlarda kersetin (10, 50, 100, 150, 200, 250 uM) ile inkübe edildiğinde, agaroz jel üzerinde lineerleştirilmiş pUC18'in hareketliliğinde bir kayma gözlemlendi ( Şekil 3B ). Ayrıca, kovalent olarak kapalı plazmit DNA, kersetin ile inkübe edildiğinde, çentikli daire durumunda hareketlilikte bir kayma gözlenirken, bir konsantrasyonda (10, 50, 100, 150, 200, 250) süper sarmal form için interkalasyonda bir artış gözlendi. μM) bağımlı şekilde. Etidyum bromür, deney için pozitif kontrol görevi gördü ( Şekil 3C ). Bu nedenle, verilerimiz, kersetin'in doğrudan DNA ile etkileşime girebileceğini göstermektedir. Figür 3Figür 3
      Quercetin'in etki şeklinin belirlenmesi.

      ( A ) DNA'da kersetin tarafından indüklenen konformasyonel değişiklikler, buzağı timus (CT) DNA'sının farklı konsantrasyonlarda kersetin (50, 100, 150 uM) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilmesiyle değerlendirildi. İnkübasyonun ardından, CD spektrumları 210-320 nm dalga boyunda kaydedildi. Etidyum bromür (10, 20 μM) ile boyanmış DNA, pozitif kontrol olarak görev yaptı. '0 μM', işlenmemiş CT DNA'dır. Kutulu bölge, bileşiklerin araya girmesi nedeniyle DNA zirvesindeki kaymayı temsil eder. ( B , C ) Jel ​​mobilite kaydırma deneyi, 100 ng pUC18 DNA kullanılarak yapıldı. Doğrusallaştırılmış (EcoRI ile sindirilmiş) ( B ) ve süper sargılı ( C) pUC18 DNA, artan kersetin konsantrasyonları (10, 50, 100, 150, 200, 250 uM) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi ve ürünler çözüldü. Etidyum bromür (2.5, 10, 25 uM) ile boyanmış DNA, tahlil için pozitif kontrol olarak görev yaptı. Lekeli DNA, 30 V'ta %1.2 agaroz jel üzerinde çözüldü. Kutular, interkalasyon nedeniyle DNA bandı pozisyonundaki kaymayı gösterir.

      Tam boyutlu resim Quercetin tedavisi, tümör hacminde önemli bir azalmaya yol açar

      İsviçre albino farelerinde gelişen meme adenokarsinomu, kuersetin ve ellagik asidin antitümör etkilerini değerlendirmek için kullanıldı. 12 inci görünür tümör saptanabilir Ehrlich ascites carcinoma (EAC) enjeksiyonu hücreleri, gün, fareler oral olarak, her üç günde 6 ya da kersetin doz (1 mg / kg) ya da ellajik asit (3 mg / kg) ile tatbik edilmiştir . Bileşiklerin ilgili dozları bir pilot çalışmaya dayalı olarak seçilmiştir (veriler gösterilmemiştir). 10 sonra, tümör taşıyan tedavi görmemiş kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında bileşiklerin her biri ile muamele edildiğinde Sonuç tümör hacminde belirgin bir azalma göstermiştir inci tedavisinin başladığı güne ( Şek. 4). Bununla birlikte, etki, ellagik asitten üç kat daha düşük bir dozda telaffuz edildiğinden, kersetin ile tedavi edilen hayvanlarda tümör boyutundaki azalma daha anlamlıydı ( Şekil 4 ). Şekil 4Şekil 4
      Farelerde kersetin ve ellagik asidin tümör büyümesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi.

      Dişi İsviçre albino farelerinde EAC hücrelerinin kas içine enjekte edilmesiyle katı tümör oluşturuldu. ( A ) Altı kersetin dozlar (1 mg / kg vücut ağırlığı) ve ( B ) ile inkübe edildi (3 mg / kg vücut ağırlığı) 12 ila üç günde bir uygulandı inci  EAC hücre enjeksiyonundan gün. Veriler, bileşiğin tedavisi ile ve olmadan farklı zaman aralıklarında tümör hacmini gösterir. Veriler, her biri beş hayvandan oluşan üç bağımsız deneyden toplandı. Hata çubukları, üç bağımsız deneyin standart sapmasını (SD) gösterir. P değeri, tedavi edilmeyen kontrol grubunun (yalnızca EAC) ortalaması ile kersetin ile tedavi edilen grubun ortalamasının karşılaştırılmasıyla hesaplandı, *P < 0.05, ***P < 0.001.

      Tam boyutlu resim Quercetin uygulaması, hiçbir yan etki olmaksızın tümör taşıyan farelerin ömrünü uzatır

      Malzemeler ve Yöntemler'de açıklandığı gibi kersetin ile tedavi edilen (1 mg/kg) tümör taşıyan farelerde yaşam süresindeki artış değerlendirildi. Tedavi edilmeyen kontrol fareleri maksimum sadece ~50 gün hayatta kalırken, kersetin ile tedavi, farelerin en az %40'ının yaşam süresinde ~5 kat artışa yol açtı ( Şekil 5A ). Bu, kuersetin uygulamasının herhangi bir yan etkiye yol açmadığını doğrular. Bu nedenle, verilerimiz farelerde kersetin tedavisinin daha düşük tümör yüküne, artan hayatta kalma ve minimum yan etkilere yol açtığını göstermektedir. Şekil 5şekil5
      Quercetin'in tümör taşıyan farelerin hayatta kalması üzerindeki etkisinin ve yan etkilerinin değerlendirilmesi.

      ( A ) Quercetin (1 mg/kg, altı doz) ile tedavi edilen dişi İsviçre albino farelerinin Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi. Deney, her biri beş hayvandan oluşan iki bağımsız grupta gerçekleştirildi. '**' anlamlılığı temsil eder, **P < 0.01. ( B ) Quercetin tedavisini takiben tümörün histopatolojik analizi. İle (tedavi edilen tümör) ve 30 sonra kersetin tedavisinde (kontrol tümörü) olmadan tümör taşıyan fare uyluk histolojik kesitler inci gün (d-f) ve (a-c) ve 45 inci gün (j-l) ve (g- i) tümör gelişimi. Gösterilen son büyütmeler 100× (a, d, g ve j paneli), 200× (b, e, h ve k paneli) ve 400× (c, f, i ve l panelidir). 'M' kastır, 'TC' tümör hücreleridir ve 'ITC' sızan tümör hücreleri anlamına gelir.

      Tam boyutlu resim
      Histopatolojik incelemede 30 kontrol ve kuersetin tedavi edilen farelerin tümör bölümündeki yapıldı inci ve 45 inci hematoksilin ve eozin boyama ile (tedavi gün Şek. 5B ). Kontrol tümör hayvanlarında ( Şekil 5B; a-c ) hematoksilin ile yüksek nükleer boyanma gözlemlendi ve böylece tedavi edilen tümöre kıyasla çok sayıda çoğalan hücrenin varlığını gösterdi ( Şekil 5B; d-f ). 30 kontrol tümör kas da inci tümör gelişme gün çarpık histoloji ve tümör hücreleri (infiltrasyonu . Şekil 5B a-c ) Quercetinin, hücre proliferasyonu ve kas mimarisinde hasarı takiben, (sınırlı ., D-f Şekil 5B). Bu durum, 45 düşürülmüştür inci Quercetinin gününde ( Şekil 5B;. J-l ) kontrol ile karşılaştırıldığında ( . Şekil 5B g-i ).

      TÜNEL boyama kuersetin, tedavi edilen tümör doku bölümü (30 gözlendi inci muamele edilmemiş kontrol tümör dokularında (karşılaştırıldığında gün) Şek. 6A, B apoptoz karakteristik bir özelliğidir DNA fragmantasyonu, varlığını düşündürmektedir). Bu nedenle, verilerimiz, kersetin tedavisinin tümör dokularında apoptozu aktive edebileceğini göstermektedir. Şekil 6şekil6
      Tümör dokularında kersetin aracılı sitotoksisite ve mekanizmasının değerlendirilmesi.

      ( A 30) TÜNEL tahlili gösteren DNA parçalanması inci muamele edilmemiş kontrol tümörünün göre kuersetin, tedavi edilen tümör dokularının gün. Kahverengi renkli çekirdekler, DNA kırılmalarını gösteren DAB boyamasını gösterirken, bozulmamış DNA'lı çekirdekler metil yeşili ile boyanmıştır. Gösterilen son büyütmeler 200× ve 400×'dir. ( B ) SEM'li çubuk diyagram (n = 5), tümör kontrolünde ve kersetin ile tedavi edilen fare dokularında % TUNEL pozitif çekirdekleri temsil eder. '*' P < 0.05'i temsil eder. ( ) immun boyama 30 sonra kontrol tümör dokularında ve kuersetin, tedavi edilen tümör dokularında, ilgili antikorlar kullanılarak Ki-67, p-p53 ve p53 parafine gömülmüş doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştir inci tedavi gün. Gösterilen son büyütme 400×'dir. ( D) IHC'nin görüntüleri nicelendirildi ve SEM olarak çizildi (n = 5). '*' anlamlılığı temsil eder (*P < 0.05, **P < 0.01).

      Tam boyutlu resim
      İmmünohistokimyasal analizi, Ki-67 (güçlü çekirdek lekelenme göstermiştir , b. Şekil 6C tedavi edilmemiş tümör doku bölümleri (30, hücresel proliferasyon markeri) inci gün). Buna karşılık, kersetin ile muamele edilmiş doku kesitlerinde önemli ölçüde daha az sayıda Ki67 pozitif hücre gözlemlendi ( Şekil 6Cc,D ). Bundan başka, p53 ve p-p53 (fosfo-p53) 'de anlamlı bir artış kuersetin, tedavi edilen tümör bölümlerinin (pozitif hücrelerinin, Şek. 6Cf, I, D muamele edilmemiş kontroller ile karşılaştırıldığında), (30 inci gün) ( Şek. 6Ce, h ) apoptotik yolun aktivasyonunu düşündürür. Primer antikoru olmayan doku bölümleri, her durumda negatif kontrol olarak görev yaptı ( Şekil 6Ca,d,g ). Quercetin tedavisi mitokondriyal membran potansiyelinin depolarizasyonu ile sonuçlanır

      Mitokondriyal membran potansiyelindeki depolarizasyon, işlenmiş ve muamele edilmemiş hücreler JC1 boyası ile boyanarak incelenmiştir. Depolarizasyon, CYTOCHROME C'nin salınmasına yol açan kırmızıdan yeşil flüoresansa bir kaymaya yol açar. İlginç bir şekilde, Nalm6 hücreleri artan konsantrasyonlarda kersetin (10, 20, 50, 100 uM) ile işlendiğinde kırmızıdan yeşil flüoresansa önemli bir kayma gözlemlendi. ) araç kontrolüne kıyasla 12 saat. Pozitif kontrol olarak 2,4 dinitro fenol (2,4-DNP) kullanıldı ( Şekil 7A ). Bu nedenle verilerimiz, kersetin aracılı sitotoksisite sırasında mitokondriyal apoptoz yolunun dahil olduğunu göstermektedir. Şekil 7şekil7
      Quercetin'in mitokondriyal transmembran potansiyeli (ΔψM) ve apoptoz üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi.

      ( A ) Nalm6 hücreleri, 12 saat boyunca kersetin (10, 20, 50 ve 100 uM) ile işlendi. Hücreler toplandı, 37 o  C'de 20 dakika JC1 boyası ile boyandı ve akış sitometresi kullanılarak analiz edildi. Mitokondriyal membran potansiyelindeki depolarizasyon, kırmızıdan yeşil flüoresansa bir kayma ile değerlendirildi; burada kırmızı, bozulmamış mitokondride JC1 agregatlarını gösterir ve yeşil, mitokondriyal potansiyelde kaybı gösteren sitozolde yeşil flüoresanslı monomerleri temsil eder. VC, DMSO ile tedavi edilen araç kontrolünü temsil eder. Çubuk diyagram, kersetin tedavisinden sonra depolarize popülasyonun yüzdesini gösterir. '*', *P < 0.05, **P < 0.01 olduğunda anlamlılığı temsil eder. 2,4 DNP ile muamele edilmiş hücre, pozitif kontrol olarak görev yaptı. ( B) Quercetin ile tedaviyi takiben apoptotik aşamaların tespiti için Nalm6 hücrelerinin Annexin V/PI ikili boyaması. Nalm6 hücreleri, 6, 12, 18, 24 ve 48 saat boyunca kuersetin (0, 20 ve 50 uM) ile muameleden sonra anneksin V-FITC/PI ile boyandı. Hücreler niceliksel ve niteliksel olarak analiz edildi. Annexin V-FITC/PI ile boyanmış hücrelerin dağılımını gösteren histogram. Her panelde sol alt kadran hem annexin V-FITC hem de PI boyamasına negatif olan hücreleri gösterir, sağ alt panel annexin V (erken apoptotik hücreler) ile boyanmış hücreleri gösterir, sol üst kadran sadece PI ile boyanmış hücreleri (nekrotik hücreler) gösterir ve sağ üst, hem anneksin V hem de PI (geç apoptotik hücreler) için pozitif olan hücreleri gösterir. 6, 12, 18 için quercetin ile tedaviyi takiben erken ve geç apoptotik hücrelerin yanı sıra nekrotik hücrelerin dağılımını gösteren histogram, sırasıyla 24 ve 48 saat. Hata çubuğu, en az iki bağımsız tekrarın standart hata ortalamasını (SEM) temsil eder. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 olduğu her durumda DMSO kontrolüne kıyasla P değeri hesaplanmıştır.

      Tam boyutlu resim
      Antitümör bileşiklerle tedaviden sonra ROS birikimi, DNA hasarı ve apoptoz geçiren hücrelerden sorumlu faktörlerden biridir. Nalm6 hücrelerinin ROS üretimi nedeniyle hücre ölümü geçirip geçirmediğini kontrol etmekle ilgilendik. Bunu test etmek için hücreler, farklı zaman noktalarında kersetin (25 μM) ile işlendi ve akış sitometrisine tabi tutuldu. H 2 O 2 kaynaklı ROS üretiminin bir pozitif kontrol olarak hizmet etmiştir. Sonuçlar, kersetin'in ROS seviyelerinde herhangi bir önemli değişikliği indüklemediğini gösterdi ( Ek Şekil 4A,B ) , bu da kersetin tarafından indüklenen hücre ölümünün ROS üretimine bağlı olmadığını ortaya koydu. Quercetin tedavisi apoptoza yol açar

      Quercetin tarafından indüklenen sitotoksisitenin gerçekten nekrozdan ziyade apoptozdan kaynaklanıp kaynaklanmadığını doğrulamak için, kersetin tedavisini takiben anneksin V-FITC/PI boyaması yapıldı. Quercetin ile muamele edilen Nalm6 hücreleri (6, 12, 18, 24 ve 48 saat boyunca 0, 20, 50 uM) annexin V-FITC/PI çift boyamaya ve ardından akış sitometrisine tabi tutuldu ( Şekil 7B).). Apoptotik hücreler, anneksin V-FITC'nin hücre zarının dış tarafında bulunan fosfotidil serine (PS) bağlanması sayesinde saptanabilir. Normal hücrelerde PS ağırlıklı olarak zarın sitozolik tarafında bulunurken, hücreler apoptoza girdiğinde zarın dış tarafına doğru yer değiştirir. Sonuçlar, 6 ve 12 saat boyunca kersetin ile tedavi üzerine erken apoptotik hücrelerde konsantrasyona bağlı bir artış gösterirken, apoptotik yolların aktivasyonunu düşündüren tedavinin 18, 24 ve 48. saatlerinde geç apoptotik hücrelerde bir artış gözlemlendi ( Şekil 7B ). Ayrıca, konfokal mikroskobik analiz, erken apoptotik fazda hücreleri düşündüren kuersetin (20 uM) ile muameleyi takiben, anneksin V-FITC (yeşil floresan) ile boyanmış hücreleri gösterdi ( Ek Şekil 5). Buna karşılık hücrelerin çoğu, daha yüksek kersetin konsantrasyonlarında (50 uM) anneksin V-FITC/PI (yeşil ve kırmızı) ile boyandı ve bu hücrelerin geç apoptoz geçirdiğini gösterdi ( Ek Şekil 5 ). Quercetin, apoptozun içsel yolunu aktive eder

      Quercetin'in apoptozu indüklediği mekanizmayı bulmak için protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için western blot çalışmaları yapıldı. Nalm6 hücreleri artan konsantrasyonlarda kuersetin (24 saat boyunca 0, 10, 20 uM) ile muamele edildi, lizat hazırlandı ve çeşitli apoptotik yol proteinleri için analiz edildi. Sonuçlar, apoptotik bir işaretleyici MCL1'in bölünmesiyle birlikte p53 ve p-p53 seviyesinde bir artış gösterdi ( Şekil 8A ; Ek Şekil 6 ). Anti-apoptotik proteinler BCL2 ve BCL-xL seviyesinde bir azalma gözlenirken, buna eşlik eden BAX seviyesinde bir artış, ayrıca bir proapoptotik protein de not edildi ( Şekil 8A).). Ayrıca, SMAC/DIABLO ile birlikte CYTOCHROME C'nin salınması, apoptoz ile sonuçlanan mitokondriyal intrinsik yolun aktivasyonunu gösterdi ( Şekil 8A ). Aktifleştirilmiş CASPASE 3, parçalanmış CASPASE 9 ve PARP1 seviyesinde gözlenen artış, böyle bir sonucu daha da doğruladı ( Şekil 8A ). Veriler nicelendirildi, tübüline göre normalleştirildi ve standart hata çubuğuyla çubuk diyagram olarak temsil edildi ( Ek Şekil 6 ). Şekil 8şekil8
      Quercetin'in apoptotik proteinlerin ekspresyonu ve etki mekanizması üzerindeki etkisi.

      ( A ) Quercetin ile tedaviyi takiben apoptotik proteinlerin ekspresyon seviyesi. Hücre lizatı, Nalm6 hücrelerinin kuersetin (0, 10, 20 uM, 24 saat boyunca) ile işlenmesinden sonra hazırlandı. Protein lizatı, SDS-PAGE üzerinde çözüldü ve uygun birincil ve ikincil antikorlar kullanılarak immünoblotlama yapıldı. p53, p-p53, BCL2, BCL-xL, BAX, MCL 1, CYTOCHROME C, SMAC/DIABLO, aktive edilmiş CASPASE 3, CASPASE 9, PARP1 ve Tubulin için ekspresyon paterni incelenmiştir. Protein transferinden sonra Ponceau lekeli PVDF membranı, eşit protein yüklemesi için bir kontrol görevi gördü. ( B) Quercetin ile muameleyi takiben Nalm6 hücrelerinde DNA parçalanmasının tespiti. Kromozomal DNA, kersetin (10, 50, 100, 250 uM) ile muameleden sonra ekstre edildi. Saflaştırılan DNA, 5 saat boyunca 50 V'de %2 agaroz jel üzerinde çözüldü. M hiper merdiven I'dir (Bioline). Pozitif kontrol olarak 5-florourasil (5-FU; 100 uM) kullanıldı. ( C) Sitotoksisiteye yol açan kersetin kaynaklı apoptoz için önerilen model. Kanser hücrelerinin kersetin ile tedavisi, mitokondriyal intrinsik yolun aktivasyonu yoluyla apoptoza yol açar. Quercetin bir DNA interkalatörü olduğundan, p53'ün yukarı regülasyonuna yol açan DNA hasarını indükleyebilir. Bu, antiapoptotik protein, BCL2'nin aşağı regülasyonu ve MCL1'in bölünmesi ile sonuçlanır. CYTOCHROME C ve SMAC/DIABLO, mitokondriyal membran potansiyelindeki kayıp nedeniyle salınır. SMAC/DIABLO IAP'leri (apoptoz proteinlerinin inhibitörleri) inhibe ederken, CYTOCHROME C salınımı CASPASE 9'un bölünmesine yol açar, bu da CASPASE 3'ü böler.

      Tam boyutlu resim
      DNA fragmantasyonu, hücre ölümünün nekrotik ve apoptotik modları arasında ayrım yapan apoptozun ayırt edici özelliklerinden biridir. DNA parçalanmasının varlığını test etmek için Nalm6 hücreleri, 48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda kersetin (0, 10, 50, 100, 250 uM) ile işlendi. 48 saat sonra artan kersetin konsantrasyonu ile endonükleaz aracılı bölünmüş DNA merdiveni yoğunluğunda bir artış gözlendi ve apoptozu daha da doğruladı ( Şekil 8B ). DNA parçalanmasını indüklediği bilinen bir bileşik olan 5-florourasil (5-FU), tahlil için pozitif kontrol olarak kullanıldı. Tartışma

      Kanser tedavileri için daha az toksisite ve daha az yan etkiye sahip güvenli, yeni ve etkili ilaçların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. DNA çift sarmal kırılmaları, tamir edilmezse genomik kararsızlığa ve kansere de yol açabilir. Dolayısıyla DSB onarım genlerini hedeflemek, kanser terapötikleri 22 için yöntemlerden biridir . Laboratuvarımızdan yapılan önceki çalışmalar, çilek 23 ve sapota 24 gibi meyvelerden hazırlanan ekstraktların , Kırmızı ağaç 25 , 26 , 27 ve MPTQ 28 , 29 , SCR7 22 , 30 gibi birçok sentetik bileşiğin kallusundan saflaştırılmış Metil Angolensat'ın sitotoksik özelliklerini göstermiştir. , 31, Levamizol türevi (4a) 32 , ASHD 33 , çeşitli kanser hücreleri üzerinde hidantoin türevleri DFH ve DCH 34 vb. Bu bileşiklerin antiproliferatif oldukları ve apoptozu indüklemek için farklı hücresel sinyal yollarına müdahale ettikleri gösterilmiştir.

      Fitokimyasallar, kanser tedavi edici özelliklerinin 35 değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır . Quercetin ve ellagic asit, tek molekül olarak veya kombinasyon halinde 1 , 2 , 21 , 36 antikanseröz ve antiproliferatif özellikleri için incelenen bu tür iki bileşiktir . Bu doğal flavonoidlerin antioksidan görevi gördüğü ve çeşitli patolojilere karşı savunma sağladığı düşünülmektedir.

      Önceki raporlar, hem kersetin hem de ellagik asidin, çeşitli insan kanser hücre dizilerinde değişen duyarlılık 1 , 12 , 16 , 37 ile sitotoksisiteyi indüklediğini gösterdi . Bizim de ex vivo tahliller, etkili bir lösemik hücrelerde bu quercetin uyarmaktadır sitotoksisite bulmak; pre-B hücre hattı, Nalm6 bir IC ile en hassas 50 20 uM (değerine Şekil. 1 ). IC bir değişen aralık 50 kersetin için daha önce rapor edilmiş 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43, 10 μM ila >100 μM arasında değişir. Bizim çalışmalarımızda kuersetin, ellagik aside göre daha sitotoksik idi. Test edilen meme kanseri hücre dizileri arasında, fareden elde edilen hücre dizisi daha fazla hassasiyet gösterdi. Bununla birlikte, insan embriyonik böbreğinden elde edilen normal hücrelerin yanı sıra fare embriyonik fibroblastları, kersetin'e karşı duyarsızdı. Yedek normal hücrelere quercetin yeteneği, daha önce rapor edilmiştir 44 . Kronik miyeloid lösemi hücre hattı, K562'nin antikanser ilaçların çoğuna direnç gösterdiği rapor edilmiştir. Bununla birlikte, önceki bir çalışma 8 ile tutarlı olan kuersetin'e karşı duyarlı olduğunu gözlemliyoruz .

      Erken zaman noktalarında (16 saat) Nalm6 hücrelerinde kersetin ile tedavi edildiğinde S fazında belirgin bir hücre döngüsü durması kaydedildi. Ayrıca, Nalm6 hücreleri 48 saat boyunca tedavi edildiğinde, Sub G1 fazındaki hücrelerde doza bağlı bir şekilde bir artış gözlendi. Bu, quercetin'in hücre bölünmesi gerçekleşmeden önce düzeltilmesi gereken DNA hasarını indükleyebileceğini düşündürmektedir. Quercetin'in DNA ile etkileşime girme yeteneği göz önüne alındığında, gözlem kolayca açıklanabilir (aşağıya bakınız). Benzer bir S fazı durması daha önce de gözlemlenmiştir 5 , 11 . Ancak, başkaları tarafından bildirildiği gibi, G0/G1 veya G2/M tutuklama gözlemlemedik 9 , 10 , 12 , 13 , 14. Kullanılan kanser tipindeki farklılık, gözlemdeki böyle bir eşitsizliği açıklayabilir.

      Quercetin tarafından indüklenen sitotoksik etki ile tutarlı olarak, tümör dokularında bile ellagik asitten 3 kat daha fazla sitotoksisiteyi indüklediğini bulduk. Etkileyici, 1 mg/kg kersetin, göğüs adenokarsinomu taşıyan farelerde tümör büyümesinin önemli ölçüde inhibisyonu için yeterliyken, eşdeğer bir etki için 3 mg/kg ellagik asit uygulamak zorunda kaldık. Mevcut çalışmada tümör regresyonunun gözlemlendiği doz, geçmiş çalışmalarda kullanılandan 10 kat daha düşüktü 19 , 45. Bu tutarsızlık, kanser hücresi tiplerindeki veya tümör geliştirmek için kullanılan fare suşlarındaki farklılıklardan kaynaklanabilir. Bu çalışmada kullanılan EAC hücreleri, fare meme adenokarsinomundan türetilen, farelerde tümörleri indüklemek için yaygın olarak kullanılan ve çeşitli bileşiklerin antikanser etkisini değerlendirmek için kullanılan farklılaşmamış habis hücre hatlarıdır 24 , 28 , 31 , 46 , 47 , 48 . Böylece, farklı kanser hücrelerinde sitotoksisiteyi indüklemede quercetin'in ellagik asitten daha etkili olduğu sonucuna varıyoruz.

      Quercetin ile tedaviyi takiben tümör taşıyan hayvanlarda, tedavi edilmemiş tümör taşıyan farelere kıyasla yaşam süresinde 5 kat artış gözlemlendi. Bu, quercetin'in normal hücreleri önemli ölçüde etkilemeden tümör hücrelerinde sitotoksisiteyi indüklediğini gösterir. Dikkat çekici bir şekilde, tümör taşıyan hayvanların en az %40'ı 250 güne kadar hayatta kaldı. Histolojik çalışmalar ve Ki-67 boyaması, tedavi edilmeyen kontrole kıyasla quercetin ile tedavi edilen tümör hayvanlarında proliferatif hücrelerde bir azalmayı ve kas mimarisinde düşük bir hasarı doğruladı.

      Küçük moleküllerin araya girmesi, DNA'da replikasyon, transkripsiyon, translasyon ve onarım gibi fizyolojik süreçleri etkileyebilen konformasyonel değişikliklere neden olur. CD spektroskopik ve jel kaydırma çalışmaları, kuersetin'in DNA'ya interkalasyon yapabildiğini gösterdi ( Şekil 3 ), bu da yakın tarihli bir rapor 38 ile tutarlıydı . DNA interkalasyonu, antikanseröz ilaçların, birikimi apoptoz ile sonuçlanabilecek DNA hasarına neden olduğu mekanizmalardan biridir. S fazında gözlenen hücre döngüsü durması, hücreler içinde DNA interkalasyonunun ardından makul bir DNA hasarı indüksiyonu ile de tutarlıydı. Ancak, o da başka bir çalışmayla da uyumludur bir antioksidan olarak hareket edebildiğini göstermektedir herhangi ROS üretimi rastlamış değiliz 49 .

      Nalm6 hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelinde depolarizasyon, tümör dokularında pozitif hücreleri boyayan TUNEL, erken ve geç apoptotik hücreleri gösteren Annexin V/PI boyaması ve jel tahlilleriyle saptanan DNA fragmantasyonu, kersetin maruziyetini takiben apoptozun aktivasyonunu önerir ( Şekil 8C ). Apoptoz, antiapoptotik proteinlerin aşağı regülasyonunu ve proapoptotik proteinlerin 50 yukarı regülasyonunu içerir . Quercetin ile tedavi, daha önceki bir rapor 51 ile tutarlı olan p53'ün yukarı regülasyonu ile sonuçlanmıştır . Antiapoptotik protein BCL2 ve BCL-xL'nin aşağı regülasyonu, BAX, p-p53'ün yukarı regülasyonu, CYTOCHROME C, SMAC/DIABLO'nun salınımı ve ayrıca CASPASE 3, CASPASE 9, PARP1 ve MCL1'in bölünmesi, içsel mitokondriyal yolun dahil olduğunu gösterdi (Şekil 8C ).

      Quercetin'in kanserlerde ve çeşitli diğer hastalıklarda çoklu hücre sinyalleşme süreçlerini etkilediği ileri sürülmektedir ( Şekil 8C ). Heterojen nükleer ribonükleoprotein A1 (hnRNPA1), prostat kanseri hücre hattı PC3 52'de kersetin hedefi olarak tanımlandı . Ayrıca, quercetin'in prostat kanserinde kirpi sinyal yolunu inhibe ettiği gösterilmiştir 53 . Önceki çalışmalar ayrıca, kersetin'in kolon adenokarsinom hücrelerinde 54 TRAIL aracılı apoptozu artırabildiğini gösterdi . Başka bir çalışma, hedef 55 olarak ABL1, Aurora-A, B, C'yi içeren kinaz setini önerdi . Bu nedenle, kersetin tedavisinin, bu çalışmada gösterildiği gibi doğrudan interkalasyon yoluyla DNA da dahil olmak üzere hücreler içindeki çoklu hedefleri etkilemesi mümkündür.

      Sonuç olarak, kersetin, çoklu etki yolları yoluyla sitotoksisiteyi indükleyebilir. Sonuçlarımız, bir DNA interkalatörü olan quercetin'in, apoptozun intrinsik yolunu aktive ederek farelerde kanser hücre hatlarında ve tümör dokularında sitotoksisiteyi indüklediğini göstermektedir. Bu nedenle, sonuçlarımız, kersetin'in kanser terapötiklerinde umut verici bir aday olduğunu göstermektedir.Malzemeler ve yöntemler

      Hücre hatları ve hücre kültürü

      İnsan kronik milejenöz lösemi hücre çizgisi (K562), insan akut lenfoblastik lösemi hücre çizgisi (CEM); insan embriyonik böbrek epitel hücre dizisi (HEK 293T), insan meme kanseri hücre dizileri (T47D), fare meme kanseri hücre dizileri (EAC) ve fare embriyonik fibroblast hücre dizisi (MEF-1), National Center for Cell Science, Pune'den satın alındı. Hindistan. İnsan B hücresi lösemi hücre dizisi (Nalm6), M. Lieber'den (ABD) bir hediyeydi. K562, CEM, T47D ve Nalm6, %10 FBS (GIBCO, BRL), 100 U Penisilin G/ml ve 100 µg streptomisin/ml ile RPMI1640 (Sera Lab, ABD) içinde 37 °C'de 5 içeren nemli atmosferde kültürlendi. % CO 2 . 293T, EAC ve MEF, %10 FBS (GIBCO, BRL), 100 U Penisilin G/ml ve 100 ug streptomisin/ml içeren DMEM içinde kültürlendi. Tripan mavisi dışlama tahlili

      Kuersetin ve ellagik asidin hücre canlılığı üzerindeki etkisi, 29 , 34'te tarif edildiği gibi tripan mavisi dışlama tahlili ile CEM, K562 ve Nalm6 hücre hatları üzerinde belirlendi . Hücreler, 0.75 x 10 bir yoğunlukta tohumlanmıştır 5 , 24 saat boyunca hücre / ml ve kuersetin ve ellajik asit (0, 10, 50, 100 ve 250 uM) 48 saat boyunca farklı konsantrasyonları ile işleme tabi tutuldu. IC 50 değeri araç kontrolü olarak DMSO ile muamele edilmiş hücreler kullanılarak, tripan mavi ile işaretlemeden sonra hücreler sayılarak belirlendi. Deney en az üç bağımsız kez tekrarlandı ve veriler standart hata ortalaması (SEM) ile çubuk diyagram olarak sunuldu. MTT tahlili

      Kuersetin ve ellagik asidin hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi, daha önce 31 , 56 anlatıldığı gibi MTT tahlili ile değerlendirildi . Lösemi hücre çizgileri (CEM, K562 Nalm6), meme kanseri hücre hatları (EAC ve T47D) ya da normal hücre çizgileri (293 T ve MEF-1) (0.75 x 10 tohumlanmıştır 5 37 ° C'de 24 saat hücre / ml) ° C ve daha sonra 48 saat boyunca 0, 10, 50, 100 ve 250 uM quercetin veya ellagic asit ile işleme tabi tutuldu ve MTT tahliline tabi tutuldu. Deney, her biri çift reaksiyon setleri ile bağımsız olarak en az üç kez tekrarlandı ve standart hata ortalaması (SEM) ile birlikte çubuk diyagram olarak sunuldu. Akış sitometrisi ile hücre döngüsü analizi

      Hücre döngüsü analizleri, 29 , 33'te tarif edildiği gibi Nalm6 hücre hattında yapıldı . 8, 16 ve 24 saat boyunca quercetin (20 uM) ile muamelenin ardından Nalm6 hücreleri üzerinde bir zaman süreci deneyi yapıldı. Nalm6 hücrelerinin yanı sıra 48 saat boyunca artan konsantrasyonlarda kersetin (0, 10, 50, 100, 250 uM) ile muamele edildi. Her iki deney hücreler 0.75 x 10 tohumlanmıştır 5hücreler/ml, hücreler quercetin muamelesinden sonra toplandı, yıkandı, sabitlendi ve RNase A ile inkübe edildi. Daha sonra hücreler propidium iyodür (50 ug/ml) ile boyandı ve okumalar akış sitometresinde (BD Biosciences FACS Calibur, ABD) elde edildi. Örnek başına minimum 10.000 hücre alındı ​​ve veriler WinMDI 2.9 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Deneyler en az iki bağımsız kez tekrarlandı ve veriler hata çubuklarıyla birlikte sunuldu. Dairesel Dikroizm (CD)

      Quercetin'in DNA bağlama yeteneği, daha önce 31 anlatıldığı gibi CD kullanılarak incelenmiştir . Quercetin (0, 50, 100, 150 µM) kesilmiş buzağı timusu (CT) DNA'sı ile tampon (10 mM Tris HCl, 15 mM NaCl) içinde 1 saat süreyle inkübe edildi ve spektrumlar JASCO'da 210-320 nm dalga boyunda kaydedildi J-810 spektropolarimetre. Tek başına tampon ve karşılık gelen DNA içermeyen kersetin konsantrasyonlarına sahip tampon için spektrumlar, deneysel verilerden çıkarıldı. CT DNA ile inkübe edilen etidyum bromürün (0, 10, 20 uM) CD spektrumları, pozitif kontrol olarak görev yaptı. DNA mobilite kayması tahlili

      Tahlil, daha önce açıklandığı gibi yapıldı31 . 100 ng süper sargılı ve doğrusallaştırılmış pUC18 plazmiti, kersetin (0, 10, 50, 100, 150, 200, 250 uM) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi ve agaroz jel üzerinde çözüldü. Daha fazla ayrıntı için ek yöntemlere bakın . Hayvan ve etik beyanı

      Fareler, Hindistan Bilim Enstitüsü'nün (IISc) hayvan bakımı etik komitesinin ilke ve yönergelerine, hayvan bakımı ve kullanımına ilişkin Hindistan Ulusal Yasasına uygun olarak sıkı sıkıya bağlı tutuldu. Bu çalışma için tasarlanan deneyler, Kurumsal Hayvan Etik Kurulu (Ref. CAF/Ethics/289/2012) IISc, Bangalore, Hindistan tarafından onaylanmıştır. Diğer ayrıntılar için ek yöntemlere bakın . EAC hücrelerinin hazırlanması ve tümör indüksiyonu

      Ehrlich ascites carcinoma hücreleri (1 x 10 Sabit sayı 6 hücre / hayvan) verici farenin karın boşluğu içine enjekte çoğalmaya bırakılmıştır. Hücreler, 1X PBS içinde seyreltilmiş, geri sayılmış ve deney hayvanları (1 x 10 sağ uyluk yeniden enjekte edilmiştir 6 katı tümör gelişimi için hücre / hayvan). Quercetin ve ellagik asidin tümör gelişimi üzerindeki antikanser etkilerinin değerlendirilmesi

      Bir partide toplam 15 fare alındı, bunlardan 10'una katı tümör geliştirmek için sağ uyluklarına EAC hücreleri enjekte edildi. 5 fare, kersetin veya ellagik asit tedavisi almayan (Grup I) tümör kontrolü olarak işlev görmedi. Tümörlü 10 fare, tümör boyutuna göre iki gruba ayrıldı, böylece her grubun ortalama tümör boyutu eşit kalır, bunlardan biri tümör kontrolü olarak görev yaptı ve tedavi görmedi (Grup II), kuersetin (1 mg/kg) gerekse ellajik asit (3 mg / kg) 12 ağızdan sonda yöntem ile diğer uygulanmıştır thküçük tümör göründüğünde EAC enjeksiyonunun yapıldığı gün (Grup III). Bu grup, her 3 günde bir 6 doz bileşik aldı. Çalışma üç bağımsız grup için tekrarlandı. Son çalışma için seçilen doz, farklı dozlarda kersetin ve ellagik asit (1, 3 ve 10 mg/kg) kullanılarak yürütülen bir pilot çalışmaya dayanmaktadır.

      Tümör hacmi, 24 , 28 , 31'de açıklandığı gibi sürmeli kumpaslar kullanılarak her bir hayvan için 4 günde bir tümör çapı ölçülerek belirlendi . Tümör hacmi, V, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır = 0.5ab 2 'a' ve 'b' olarak büyük ve küçük çapı sırasıyla temsil 31 . 30 sonra, inci ve 45 inci servikal dislokasyon ve dokuların her gruptan kurban edildi günde bir hayvan normal kontrol için ayrıca, sabit ve birden çok toplu hayvanları tedavi edildi. Quercetin'in tümör hayvanlarının hayatta kalmasına etkisinin belirlenmesi

      Quercetin ile tedavi edilen farelerin hayatta kalma yüzdesi hesaplandı ve kontrol hayvanları ile karşılaştırıldı. Her kontrol ve kersetin ile tedavi edilen gruplara tümör taşıyan beş hayvan alındı. Çalışma iki bağımsız grupta yapıldı. Kontrol ve tedavi edilen hayvanların ölüm modeli rapor edildi ve yaşam süresindeki artış yüzdesi [(TC)/C] x 100 formülü kullanılarak hesaplandı; burada T, tedavi edilen hayvanların hayatta kalma süresini gösterirken C, kontrol hayvanlarının hayatta kalma süresini temsil eder 24 , 28 , 46 . Tedavi edilen hayvanlar en az 250 gün boyunca izlendi. histolojik değerlendirme

      Kontrol ve kersetin ile tedavi edilen hayvanlardan tümör dokuları toplandı. Dokular parafin mumu içine gömüldü ve döner mikrotomda (Leica Biosystems, Almanya) 5 um'lik bölümler kesildi. Kesitler parafinize edildi ve hematoksilen ve eozin boyama 23 , 57'de açıklandığı gibi yapıldı . Kesitler, ışık mikroskobu (Carl Zeiss, Almanya) kullanılarak yapısal değişiklikler açısından değerlendirildi ve görüntüler alındı. TUNEL testi

      Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) tahlili, DNA fragmantasyon Tespit Kiti (Calbiochem, ABD) kullanılarak yapıldı. Daha fazla ayrıntı için ek yöntemlere bakın . İmmünohistokimya (IHC)

      31 , 57'den önce tarif edildiği gibi kersetin ile muamele edilmiş doku bölümlerinde immünohistokimyasal boyama yapıldı . Daha fazla ayrıntı için ek yöntemlere bakın . Mitokondriyal membran potansiyelindeki değişikliği tespit etmek için JC1 boyaması

      Bir floresan karbosiyanin boyası olan 5,5',6,6'-tetrakloro-1,1',3,3' tetraetilbenzimidazolilkarbosiyanin iyodür/klorür (JC-1), mitokondri 25'in zar ötesi potansiyelini (ΔψM) kontrol etmek için kullanıldı . Daha fazla ayrıntı için ek yöntemlere bakın . Apoptotik aşamalar için Annexin V-FITC/propidium iyodür (PI) boyaması

      Annexin V-FITC/PI boyama, 34 tarif edildiği gibi, erken ve geç apoptotik hücresel aşamaları tespit etmek için gerçekleştirilmiştir . Daha fazla ayrıntı için ek yöntemlere bakın . immünoblotlama

      Nalm6 hücre çizgileri 0.75 x 10 bir yoğunlukta tohumlanmıştır 5 , 24 saat boyunca hücre / ml. Quercetin (0, 10, 20 uM, 24 saat) ile muameleyi takiben hücreler toplandı ve RIPA tamponu (25 mM Tris (pH 7.6), 150 mM NaCl, %1 NP-40, %1 sodyum deoksikolat) içinde lizat hazırlandı. ve %0.1 SDS) açıklandığı gibi 34 , 57. Protein konsantrasyonu Bradford tahlili ile belirlendi. Yaklaşık olarak 30 µg lizat %10-12 SDS-PAGE'de çözüldü ve PVDF membranına (Millipore, ABD) aktarıldı. Membran bloke edildi ve ilgili birincil antikorlarla (BCL2, BAX, MCL1, CASPASE 9, aktive edilmiş CASPASE 3, CYTOCHROME C, p53, p-p53, SMAC/DIABLO, BCL-xL, PARP1, Tubulin) gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi. Lekeler yıkandı, HRP-konjuge ikincil antikorlarla inkübe edildi, kemilüminesan solüsyon (Immobilon TM western, Millipore, ABD) kullanılarak geliştirildi ve jel dokümantasyon sistemi (ImageQuant LAS4000, GE, ABD) kullanılarak tarandı. Deney en az üç bağımsız kez tekrarlandı. DNA parçalanma tahlili

      Nalm6 hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi kersetin (0, 10, 50, 100, 250 uM) ile muamele edildi ve DNA parçalanma analizi 58 yapıldı . Daha fazla ayrıntı için ek yöntemlere bakın . istatistiksel analiz

      Veriler, normal ve deney hayvanları için ortalama ± SEM olarak ifade edildi. İstatistiksel analiz, iki yönlü ANOVA ve Graph pad prizma 5.1 yazılımı kullanılarak öğrenci t-testi ile gerçekleştirilmiştir. P ≤ 0.05 olduğunda değerler anlamlı kabul edildi. Kaplien-Meier hayatta kalma eğrisi de Graph pad prizma 5.1 kullanılarak çizildi.ek bilgi

      Bu makaleden nasıl alıntı yapılır : Srivastava, S. et al . Doğal Bir Flavonoid olan Quercetin, DNA ile Etkileşime Girer, Hücre Döngüsünü Durdurur ve Mitokondriyal Apoptoz Yolunu Aktive Ederek Tümör Gerilemesine Neden Olur. bilim Cum . 6 , 24049; doi: 10.1038/srep24049 (2016).Referanslar

      1. Mertens-Talcott, SU & Percival, SS Ellagik asit ve kersetin, apoptozun uyarılmasında resveratrol ile sinerjistik olarak etkileşime girer ve insan lösemi hücrelerinde geçici hücre döngüsü durmasına neden olur. Kanser Lett 218, 141-151 (2005).

        CAS PubMed Google Akademik
      2. Mertens-Talcott, SU, Talcott, ST & Percival, SS Düşük kersetin ve ellagik asit konsantrasyonları, MOLT-4 insan lösemi hücrelerinde proliferasyonu, sitotoksisiteyi ve apoptozu sinerjistik olarak etkiler. J Nutr 133, 2669-2674 (2003).

        CAS PubMed Google Akademik
      3. Haghiac, M. & Walle, T. Quercetin, SCC-9 ağız kanseri hücrelerinde nekroz ve apoptozu indükler. Nutr Cancer 53, 220–231 (2005).

        CAS PubMed Google Akademik
      4. Senthilkumar, K. ve ark. Quercetin, insülin benzeri büyüme faktörü sinyalleşmesini düzenler ve androjenden bağımsız prostat kanseri hücrelerinde (PC-3) içsel ve dışsal yol aracılı apoptozu indükler. Mol Cell Biochem 344, 173–184 (2010).

        CAS PubMed Google Akademik
      5. Zhang, H. et al. İnsan kolon ve meme kanseri hücre dizilerinde quercetin ve quercetin-5′,8-disülfonatın antitümör aktiviteleri. Gıda Kimyasal Toksikol 50, 1589–1599 (2012).

        CAS PubMed Google Akademik
      6. Kim, GN & Jang, HepG2 hücrelerinde H202 kaynaklı oksidatif stres üzerinde glutatyon metabolizmasını kullanan quercetin ve rutinin HD Koruyucu mekanizması. Ann NY Acad Sci 1171, 530-537 (2009).

        REKLAMLAR CAS PubMed Google Akademik
      7. Robaszkiewicz, A., Balcerczyk, A. & Bartosz, G. Quercetin'in A549 hücreleri üzerindeki antioksidan ve prooksidatif etkileri. Cell Biol Int 31, 1245–1250 (2007).

        CAS PubMed Google Akademik
      8. Brisdelli, F., Coccia, C., Cinque, B., Cifone, MG & Bozzi, A. Apoptozun kersetin tarafından uyarılması: insan kronik miyeloid (K562) ve akut lenfoblastik (HSB-2) lösemi hücrelerinin farklı tepkisi. Mol Cell Biochem 296, 137–149 (2007).

        CAS PubMed Google Akademik
      9. Yuan, Z. et al. PI3K/Akt'yi azaltarak HL-60 hücrelerinin kuersetin kaynaklı apoptozu. Mol Biol Temsilcisi 39, 7785–7793 (2012).

        CAS PubMed Google Akademik
      10. Yoshida, M., Yamamoto, M. & Nikaido, T. Quercetin, hücre döngüsünün geç G1 fazında insan lösemik T hücrelerini tutuklar. Cancer Res 52, 6676-6681 (1992).

        CAS PubMed Google Akademik
      11. Richter, M., Ebermann, R. & Marian, Kolorektal tümör hücrelerinde B. Quercetin kaynaklı apoptoz: EGF reseptörü sinyallemesinin olası rolü. Nutr Cancer 34, 88–99 (1999).

        CAS PubMed Google Akademik
      12. Choi, JA ve ark. İnsan meme kanseri hücrelerinde hücre döngüsü durması ve apoptozun quercetin tarafından uyarılması. Int J Oncol 19, 837-844 (2001).

        CAS PubMed Google Akademik
      13. Lee, TJ ve ark. Quercetin, G2/M fazını durdurur ve U937 hücrelerinde kaspaz bağımlı hücre ölümünü indükler. Kanser Lett 240, 234-242 (2006).

        CAS PubMed Google Akademik
      14. Zhang, Q., Zhao, XH & Wang, ZJ Flavonlar ve flavonoller, G2/M durmasına neden olarak ve apoptozu indükleyerek insan özofagus adenokarsinom hücre hattı (OE33) üzerinde sitotoksik etkiler gösterir. Gıda Kimyasal Toxicol 46, 2042-2053 (2008).

        CAS PubMed Google Akademik
      15. Pitchakarn, P. ve ark. Ellagik asit, prostat kanseri hücre hatlarının göçünü ve istilasını engeller. Asya Pac J Kanser Önceki 14, 2859–2863 (2013).

        PubMed Google Akademik
      16. Narayanan, BA, Geoffroy, O., Willingham, MC, Re, GG & Nixon, DW p53/p21(WAF1/CIP1) ifadesi ve ellagic asit ile tedavi edilen kanser hücrelerinde G1 tutuklanması ve apoptozdaki olası rolü. Cancer Lett 136, 215–221 (1999).

        CAS PubMed Google Akademik
      17. Yang, F. et al. Quercetin ve 2-Methoxyestradiol Kombinasyonu, İnsan Prostat Kanseri LNCaP ve PC-3 Hücrelerinin Ksenogreft Tümör Büyümesinin İnhibisyonunu Artırır. Plos Bir 10, e0128277 (2015).

        PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      18. Ravishankar, D. et al. Antianjiyogenik ajanlar olarak kersetin ve luteolin türevlerini keşfetmek. Eur J Med Chem 97, 259–274 (2015).

        CAS PubMed Google Akademik
      19. Wang, G., Zhang, J., Liu, L., Sharma, S. & Dong, Q. Quercetin, p53/Bcl-xl yoluyla karaciğer kanserine karşı doksorubisin aracılı antitümör etkilerini güçlendirir. Plos Bir 7, e51764 (2012).

        REKLAMLAR CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      20. Nessa, MU, Beale, P., Chan, C., Yu, JQ & Huq, İnsan yumurtalık tümörü modellerinde sisplatin ve oksaliplatin ile kuersetin ve timokinon kombinasyonlarından F. Sinerjizm. Antikanser Res 31, 3789–3797 (2011).

        CAS PubMed Google Akademik
      21. Akagi, K. et al. Sıçan orta vadeli çok organlı karsinogenez modelinde ellagik asit, vanilin ve kersetin'in modüle edici etkileri. Cancer Lett 94, 113–121 (1995).

        CAS PubMed Google Akademik
      22. Srivastava, MRS DNA çift sarmallı kırık onarım inhibitörleri, kanser terapötikleri olarak. Chem Biol 22, 17–29 (2015).

        CAS PubMed Google Akademik
      23. Somasagara, RR ve ark. Çilek meyvelerinin özleri, meme kanseri hücrelerinde içsel apoptoz yolunu indükler ve farelerde tümör ilerlemesini engeller. Plos Bir 7, e47021 (2012).

        REKLAMLAR CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      24. Srivastava, M. et al. Sapodilla erik (Achras sapota), kanser hücre dizilerinde apoptozu indükler ve farelerde tümör ilerlemesini engeller. Bilim Temsilcisi 4, 6147 (2014).

        CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      25. Chiruvella, KK ve ark. Doğal bir tetranortriterpenoid olan metil angolensat, lösemik hücrelerde içsel apoptotik yolu indükler. FEBS Lett 582, 4066–4076 (2008).

        CAS Google Akademik
      26. Chiruvella, KK, Panjamurthy, K., Choudhary, B., Joy, O. & Raghavan, SC Hint sekoyasının kallusundan elde edilen metil angolensat, insan meme kanseri hücrelerinde sitotoksisiteye neden olur. Int J Biomed Sci 6, 182–194 (2010).

        CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      27. Chiruvella, KK & Raghavan, SC Doğal bir bileşik olan metil angolensat, Daudi hücrelerinde mitokondriyal apoptoz yolunu indükler. Invest New Drugs 29, 583–592 (2011).

        CAS PubMed Google Akademik
      28. Sharma, S. et al. Yeni bir DNA interkalatörü, 8-metoksi pirimido[4',5':4,5]tieno (2,3-b)kinolin-4(3H)-one, kanser hücrelerinde apoptozu indükler, tümör ilerlemesini engeller ve yaşam süresini uzatır. tümörlü fareler. Mol Carcinog 52, 413–425 (2013).

        CAS Google Akademik
      29. Shahabuddin, MS, Nambiar, M., Choudhary, B., Advirao, GM & Raghavan, SC A new DNA intercalator, butylamino-pyrimido[4′,5′:4,5]selenolo(2,3-b)quinoline, lösemik hücrelerde hücre döngüsü durmasını ve apoptozu indükler. Invest New Drugs 28, 35-48 (2010).

        CAS Google Akademik
      30. John, F. et al. Pluronic kopolimer, SCR7'yi potansiyel bir antikanser ajanı olarak kapsülledi. Faraday Tartışma 177, 155-161 (2015).

        REKLAMLAR CAS PubMed Google Akademik
      31. Srivastava, M. et al. Homolog olmayan uç birleştirmenin bir inhibitörü, çift zincirli kopma onarımını iptal eder ve kanserin ilerlemesini engeller. Hücre 151, 1474-1487 (2012).

        CAS Google Akademik
      32. Hegde, M. et al. Yeni levamizol türevi, kanser hücrelerinde dış apoptoz yolunu indükler ve farelerde tümör ilerlemesini engeller. Plos Bir 7, e43632 (2012).

        REKLAMLAR CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      33. Kavitha, CV ve ark. Propil-2-(8-(3,4-diflorobenzil)-2',5'-diokso-8-azaspiro[bisiklo[3.2.1]oktan-3,4'-imidazolidin]-1'-il) asetat indükler hücre döngüsü durmasını takiben mitokondriyal yol yoluyla insan lösemi hücrelerinde apoptoz. Plos Bir 8, e69103 (2013).

        REKLAMLAR PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      34. Kavitha, CV ve ark. Spirohidantoinin yeni türevleri, lösemi hücrelerinde apoptozu takiben büyüme inhibisyonunu indükler. Biochem Pharmacol 77, 348-363 (2009).

        CAS Google Akademik
      35. Overby, A., Zhao, CM & Chen, D. Bitki fitokimyasalları: mide kanserine karşı potansiyel antikanser ajanları. Curr Opin Pharmacol 19C, 6–10 (2014).

        Google Akademik
      36. Khanduja, KL, Gandhi, RK, Pathania, V. & Syal, N. Farelerde ellagic asit ve kersetin ile N-nitrosodietilamin kaynaklı akciğer tümörijenezinin önlenmesi. Food Chem Toxicol 37, 313–318 (1999).

        CAS PubMed Google Akademik
      37. Umesalma, S., Nagendraprabhu, P. & Sudhandiran, G. Ellagik asit, HCT-15 kolon adenokarsinom hücrelerinde Akt sinyal yolu yoluyla proliferasyonu inhibe eder ve apoptozu indükler. Mol Cell Biochem 399, 303–313 (2014).

        PubMed Google Akademik
      38. Bishayee, K. ve ark. Quercetin, apoptozu teşvik etmek ve G2/M'de, servikal karsinomda hücre döngüsünü durdurmak için sitokrom-c salınımını ve ROS birikimini indükler: sinyal kaskadı ve ilaç-DNA etkileşimi. Cell Prolif 46, 153-163 (2013).

        CAS PubMed Google Akademik
      39. Borçka, S. et al. Quercetin'in insan mide kanseri üzerindeki in vitro etkisi: kanser hücrelerinin ölümünü ve MDR'yi hedefleme. Gıda Kimyasal Toxicol 50, 3375–3383 (2012).

        CAS PubMed Google Akademik
      40. Huang, SL, Hsu, CL & Yen, GC Quercetin'in SW 872 insan liposarkom hücreleri üzerinde büyümeyi önleyici etkisi. Life Sci 79, 203-209 (2006).

        CAS PubMed Google Akademik
      41. Wenzel, U., Herzog, A., Kuntz, S. & Daniel, H. Protein ekspresyon profili, insan kolon kanseri hücrelerinde ana diyet flavonoidi olarak kersetin moleküler hedeflerini tanımlar. Proteomik 4, 2160–2174 (2004).

        CAS PubMed Google Akademik
      42. Huang, YT ve ark. Epidermal büyüme faktörü reseptörünü aşırı eksprese eden A431 hücrelerinde tirozin kinaz inhibitörleri olan luteolin ve kersetin'in hücre büyümesi ve metastazla ilişkili özellikler üzerindeki etkileri. Br J Pharmacol 128, 999–1010 (1999).

        CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      43. Yoshida, M. et al. Quercetin'in hücre döngüsü ilerlemesi ve insan mide kanseri hücrelerinin büyümesi üzerindeki etkisi. FEBS Lett 260, 10-13 (1990).

        CAS PubMed Google Akademik
      44. Oğul, YO et al. Quercetin'in normal ve dönüştürülmüş fare hepatik hücre hatlarında hücre büyümesi ve antioksidan savunma sistemi üzerindeki seçici etkileri. Eur J Pharmacol 502, 195–204 (2004).

        REKLAMLAR CAS PubMed Google Akademik
      45. Pratheeshkumar, P. et al. Quercetin, VEGFR-2 ile düzenlenen AKT/mTOR/P70S6K sinyal yollarını hedefleyerek anjiyogenez aracılı insan prostat tümörü büyümesini inhibe eder. Plos Bir 7, e47516 (2012).

        REKLAMLAR PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      46. Noaman, E., Badr El-Din, NK, Bibars, MA, Abou Mossallam, AA & Ghoneum, M. Arabinoksilan pirinç kepeği tarafından antioksidan potansiyeli, MGN-3/biobran, murin katı Ehrlich karsinomuna karşı onkostatik etkisi için bir mekanizmayı temsil eder. . Kanser Lett 268, 348–359 (2008).

        CAS PubMed Google Akademik
      47. Gekeler, V., Epple, J., Kleymann, G. & Probst, H. Ehrlich assit hücrelerinin erken-S-faz replikonlarının seçici ve senkron aktivasyonu. Mol Celi Biol 13, 5020–5033 (1993).

        CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      48. Kumar, A. et al. İkame edilmiş-1,3,4-oksadiazol türevlerinin antianjiyogenik ve antiproliferatif etkilerine, VEGF'nin aşağı regülasyonu ve Ehrlich assit tümör hücrelerinde HIF-1alfa'nın translokasyonunun inhibisyonu aracılık eder. Cancer Chemother Pharmacol 64, 1221–1233 (2009).

        CAS PubMed Google Akademik
      49. Vidya Priyadarsini, R. et al. Flavonoid kersetin, p53 indüksiyonu ve NF-kappaB inhibisyonu yoluyla insan rahim ağzı kanseri (HeLa) hücrelerinde hücre döngüsü durmasını ve mitokondri aracılı apoptozu indükler. Eur J Pharmacol 649, 84–91 (2010).

        CAS PubMed Google Akademik
      50. Hengartner, MO Apoptozun biyokimyası. Doğa 407, 770–776 (2000).

        REKLAMLAR CAS PubMed Google Akademik
      51. Chan, ST, Yang, NC, Huang, CS, Liao, JW & Yeh, SL Quercetin, in vitro ve in vivo olarak p53 protein ekspresyonunun yukarı regülasyonu yoluyla trikostatin A'nın antitümör aktivitesini arttırır . Plos Bir 8, e54255 (2013).

        REKLAMLAR CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      52. Ko, CC ve ark. Kimyasal proteomik, PC-3 hücrelerinde anti-kanser etkilerinde kersetin moleküler hedefi olarak heterojen nükleer ribonükleoprotein (hnRNP) A1'i tanımlar. J Biol Chem 289, 22078–22089 (2014).

        CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      53. Slusarz, A. ve ark. Yaygın botanik bileşikler, prostat kanserinde kirpi sinyal yolunu inhibe eder. Cancer Res 70, 3382–3390 (2010).

        CAS PubMed Google Akademik
      54. Psahoulia, FH, Drosopoulos, KG, Doubravska, L., Andera, L. & Pintzas, A. Quercetin, lipid sallarında ölüm reseptörlerinin birikmesini indükleyerek kolon kanseri hücrelerinde TRAIL aracılı apoptozu arttırır. Mol Kanser Tedavisi 6, 2591–2599 (2007).

        CAS Google Akademik
      55. Boly, R. et al. Quercetin, kanser hücresi biyolojisinde yer alan büyük bir kinaz panelini inhibe eder. Uluslararası J Oncol 38, 833-842 (2011).

        CAS PubMed Google Akademik
      56. Freimoser, FM, Jakob, CA, Aebi, M. & Tuor, U. MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] tahlili, kolorimetrik için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. mantar hücre yoğunluklarının belirlenmesi. Appl Environ Microbiol 65, 3727–3729 (1999).

        CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
      57. Sharma, S., Choudhary, B. & Raghavan, SC Homolog olmayan DNA uç birleştirmesinin etkinliği, mekanizmadaki benzerliğe rağmen somatik dokular arasında değişiklik gösterir. Cell Mol Life Sci 68, 661–676 (2011).

        CAS Google Akademik
      58. Sahu, U. et al. Yeni Bir Antikanser Ajan, 8-Methoxypyrimido[4′,5′:4,5]thieno(2,3-) Quinoline-4(3H)-One, p53-Bağımlı, Kaspaz-Bağımlı ve - Bağımsız Apoptotik Yollar. Plos Bir 8, e66430 (2013).

        REKLAMLAR CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik

      Referansları indirTeşekkür

      Dr. M. Nambiar, Bay R. Sebastian, Bayan M. Pandey ve SCR laboratuvarının diğer üyelerine el yazması hakkındaki tartışmalar ve yorumlar için teşekkür ederiz. Central Animal Facility, Dr. Uttara Chakraborty ve FACS Facility and Confocal Facility, IISc'nin diğer üyelerine yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, IISc-DBT ortaklık programından [DBT/BF/PR/INS/2011–12/IISc] sağlanan hibelerle desteklenmiştir. SS ve RRS, UGC, Hindistan'dan Dr. DS Kothari Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir ve NM, CSIR'den SRF tarafından desteklenmektedir.Yazar bilgileri

      Bağlantılar

      1. Biyokimya Bölümü, Hindistan Bilim Enstitüsü, Bangalore, 560 012, Hindistan

        Shikha Srivastava, Ranganatha R. Somasagara, Mahesh Hegde, Mayilaadumveettil Nishana, Satish Kumar Tadi, Mrinal Srivastava & Sathees C. Raghavan
      2. Biyoinformatik ve Uygulamalı Biyoteknoloji Enstitüsü, Electronics City, Bangalore, 560 100, Hindistan

        bibha choudhary
      Katkılar

      SCR, SS ve RRS deneyleri tasarladı ve tasarladı; SS, RRS, MH, NM, TSK, BC ve MS deneyleri gerçekleştirdi ve verileri analiz etti; SCR ve SS taslağı yazdı.Etik beyanları

      rekabet eden çıkarlar

      Yazarlar hiçbir rekabet eden finansal çıkar beyan etmemektedir.Elektronik ek malzeme

      Ek bilgi

      Haklar ve izinler

      Bu çalışma, Creative Commons Atıf 4.0 Uluslararası Lisansı ile lisanslanmıştır. Bu makaledeki görseller veya diğer üçüncü şahıs materyalleri, kredi limitinde aksi belirtilmedikçe makalenin Creative Commons lisansına dahildir; materyal Creative Commons lisansı kapsamında değilse, kullanıcıların materyali çoğaltmak için lisans sahibinden izin almaları gerekecektir. Bu lisansın bir kopyasını görüntülemek için http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ adresini ziyaret edin.

      Yeniden Baskılar ve İzinlerBu makale hakkında

      CrossMark aracılığıyla para birimini ve orijinalliği doğrulayın Bu makaleden alıntı yap

      Srivastava, S., Somasagara, R., Hegde, M. et al. Doğal Bir Flavonoid olan Quercetin, DNA ile Etkileşime Girer, Hücre Döngüsünü Durdurur ve Mitokondriyal Apoptoz Yolunu Aktive Ederek Tümör Gerilemesine Neden Olur. Bilim Temsilcisi 6, 24049 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24049

      Alıntıyı indirBu makaleyi paylaş

      Aşağıdaki bağlantıyı paylaştığınız herkes bu içeriği okuyabilir:
      Paylaşılabilir bağlantı alın
      Springer Nature SharedIt içerik paylaşım girişimi tarafından sağlanmıştır konular

      daha fazla okuma

      Yorumlar

      Bir yorum göndererek, Şartlarımıza ve Topluluk Kurallarımıza uymayı kabul etmiş olursunuz . Kötüye kullanım içeren veya şartlarımıza veya yönergelerimize uymayan bir şey bulursanız, lütfen uygunsuz olarak işaretleyin.

      Yorum yap


      • #4
        Artemisia annua bitkisel preparatının antitümör aktivitesi ve aktif bileşenlerin tanımlanması

        Yazar bağlantıları bindirme panelini açar

        Sophia J. Lang birMichael Schmiech birSusanne Hafner birHıristiyan Paetz bCarmen steinborn cRoman Huber cMenna El Gaafary bir dKatharina Werner birChristoph S. Schmidt birTatiana Syrovets birThomas Simmet bir
        Daha fazla göster
        Mendeley'e ekle
        Paylaş
        Anmak
        https://doi.org/10.1016/j.phymed.2019.152962Hakları ve içeriği alın
        Creative Commons lisansı altında
        açık Erişim tarafından atıfta bulunulan Michael Schmiech, Sophia J. Lang, Tatiana Syrovets, Thomas Simmet
        Artemisia annua bitkisel preparatının sitotoksik aktivitesine ve aktif bileşen analizi için nicelleştirme yönteminin doğrulanmasına ilişkin veriler
        Kısaca Veriler, Cilt 27, Aralık 2019, Sayfa 104635


        PDF İndirSoyut

        Arka plan
        Artemisia annua L., antikanser aktivitesi nedeniyle artan bir ilgi görmüştür . Bununla birlikte, artemisinin yanında ,Artemisia annua'nınolası biyoaktif bileşenlerive ilgili bitkisel preparatlar hakkında daha az şey bilinmektedir. Artemisininyanı sıra,Artemisia annuapreparatlarının potansiyel antikanser aktivitesine sahip birden fazla bileşen içerebileceğinivarsaydık.

        yöntemler
        MDA-MB-231 üçlü negatif insan meme kanseri (TNBC) hücreleri ile birlikte diğer tedaviye dirençli, metastatik kanser hücre dizileri , bitkisel bir preparasyon olarak pazarlanan bir Artemisia annua özütünün antikanser etkinliğini araştırmak için in vitro ve in vivo araştırmak için kullanıldı. saptanabilir artemisinin (tespit sınırı = 0,2 ng/mg). Özüt, HPLC-DAD ile özelliği tayin edilmiş ve en bol bileşikler ile tanımlandı 1 H- ve 13 UHPLC-MS / MS ile NMR spektroskopisi ve nicelleştirilmiştir. Hücre canlılığı ve çeşitli apoptotik parametreler, akış sitometrisi ile ölçülmüştür. In vitro veriler iki in vivo olarak doğrulanmıştırKanser modelleri, piliç chorioallantoic membran ı (CAM) tahlili ve ortotopik meme içinde kanseri ksenograftlarının olarak çıplak fareler .

        Sonuçlar
        Artemisia annua ile gelişmiş olabilir aktivitesi olan özü, asetonitril maserasyon, olmayan meme (MDA-MB-231 ve MCF-7), pankreas (MIA PaCa-2), prostat (PC-3) canlılığını inhibe küçük hücreli akciğer kanseri (A459) hücreleri, normal meme epitel hücreleri, lenfositler ve PBMC , ekstrakt tedavisine nispeten dirençliydi. Benzer şekilde, ekstrenin en bol bulunan bileşenleri, chrysosplenol D, arteannuin B ve castisin, ancak arteannuic asit veya 6,7- dimetoxycoumarin değil , MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin canlılığını inhibe etti . Ekstrakt, tedavinin 24 saati içinde çok çekirdekli kanser hücrelerinin birikmesine neden oldu, S ve G 2'deki hücre sayısını artırdıHücre döngüsünün /M fazları, ardından mitokondriyal membran potansiyeli kaybı , kaspaz 3 aktivasyonu ve apoptotik hipodiploid hücre popülasyonunun oluşumu. Bundan başka, ekstre inhibe edici kanser hücresi proliferasyonunu, tümör büyümesini ve indüklenen azalma apoptozu in vivo TNBC, MDA-MB-231 ksenograftları CAM ve aynı zamanda çıplak farelerde büyümüş.

        Çözüm
        Artemisinin eksikliği olan bir Artemisia annua bitkisel preparatının özü, üçlü negatif insan meme kanserine karşı güçlü antikanser aktivite sergiler. Artemisia annua özütünün potansiyel antikanser aktivitesine sahip yeni aktif bileşenleri tanımlanmıştır.

        grafik soyut

        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indir (122KB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir
        anahtar kelimeler

        Artemisia annua özü Meme kanseri NBC apoptozHücre döngüsü KAM Kısaltmalar ACN asetonitril ALT alanin aminotransferaz AST aspartat aminotransferaz
        ATCC Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu KAM civciv korioallantoik zar Ψ m mitokondriyal membran potansiyeli
        CFSE
        karboksifloresein diasetat süksinimidil ester
        BABA
        diyot dizi dedektörü
        DMEM
        Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı
        DMSO
        dimetil sülfoksit
        DNA
        deoksiribonükleik asit
        ESI
        elektrosprey iyonizasyon
        FCS
        fetal buzağı serumu
        FITC
        floresan izotiyosiyanat
        O
        hematoksilen ve eozin boyama
        HP-β-CD
        (2-hidroksipropil)-β-siklodekstrin
        HPLC-MS
        yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi
        IC 50
        yarı maksimum inhibitör konsantrasyon
        LOD
        Algılama limiti
        NMR
        nükleer manyetik rezonans
        NSCLC
        kucuk hucreli olmayan akciger kanseri
        PBS
        fosfat tamponlu tuzlu su
        PBMC
        periferik kan mononükleer hücreleri
        ROS
        Reaktif oksijen türleri
        RT
        oda sıcaklığı
        TNBC
        üçlü negatif insan meme kanseri
        TÜNEL
        terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick uç etiketleme
        XTT
        2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-2H-tetrazolyum-5-karboksanilid
        UHPLC-MS/MS
        ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi - tandem kütle spektrometrisi Tanıtım


        Şifalı bitki Artemisia annua L. geleneksel çay ya da basın suyu şeklinde Asya ve Afrika genelinde sıtma tedavisinde kullanılır. Seskiterpen lakton Artemisinin aktif madde olarak tanımlandı Artemisia annua özleri ( Slezakova ve Ruda-Kučerová, 2017 ) . Son yıllarda, Artemisia annua preparatları antikanser özellikleri nedeniyle artan bir ilgi görmüştür. Artemisinin zayıf biyoyararlanımı nedeniyle, çoğunlukla artemisinin yarı sentetik türevleri, kansere ve altta yatan moleküler etki biçimlerine karşı etkinlikleri açısından araştırıldı. Gerçekten de, bazıları şu anda klinik çalışmalarda test edilmektedir (Eferth, 2017 ). Bununla birlikte, mevcut kanıtlar, artemisinin bu tıbbi bitkinin en aktif antikanser bileşeni olmayabileceğini düşündürmektedir ( Efferth ve diğerleri, 2011 , Ferreira ve diğerleri, 2010 ). Bitki, çok sayıda başka biyolojik olarak aktif madde içerir ( Ferreira ve diğerleri, 2010 , Wang ve diğerleri, 2009 ), Artemisia annua'nın yeni bir bitkisel antikanser terapötik kaynağı olabileceğini düşündürür. Bitkisel müstahzarlar olarak pazarlanan Artemisia annua özlerinin uygulanması hakkında bazı olumlu vaka raporları olmasına rağmen , genel olarak Artemisia annua özleri hakkında daha az şey bilinmektedir.malign hastalıklardan muzdarip insanlar ve evcil hayvanlarda ( Breuer ve Efferth, 2014 , Efferth, 2017 ).

        Doğal ürünler, potansiyel farmakoterapötik değere sahip yeni moleküler yapıların tanımlanması için çok önemli bir kaynak olarak kabul edilmiştir ve halen de kabul edilmektedir ( Atanasov ve diğerleri, 2015 , Koehn ve Carter, 2005 , Nosrati ve diğerleri, 2018 ). Bu nedenle, bitkisel preparat olarak pazarlanan bir Artemisia annua ekstraktını kimyasal olarak karakterize ettik ve fraksiyonladık . Ayrıca, ekstraktın en bol bulunan bileşenlerini belirledik ve hiçbir artemisinin içermediğini doğrulanabilir bir şekilde gösterdik. Artemisia annua'yı daha da analiz ettik. Terapötik etkinliğini kanıtlamak ve artemisinden farklı aktif maddeleri tanımlamak amacıyla yüksek oranda metastatik üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerine karşı aktivitesi için özüt.Malzemeler ve yöntemler

        Genel deneysel prosedürler


        Momundo Artemisia annua özü (PZN 5466281) MoMundo GmbH'den (Bad Emstal, Almanya) elde edildi. Arteannuin B ve arteannuik asit , Carbosynth'ten (Berkshire, UK), castisin ve Extrasynthese'den (Genay cedex, Fransa) 6,7-dimethoxycoumarin ve ChemFaces'ten (Wuhan, Hubei, Çin) chrysosplenol D idi. Stok çözeltiler, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlandı ve ortam ile daha da seyreltildi. Ortamdaki son DMSO konsantrasyonu, tüm deneylerde %0.5 idi. Propidium iyodür , DNaz içermeyen RNaz A , (2-hidroksipropil)-β-siklodekstrin (HP-β-CD), paklitaksel ve doksorubisin hidroklorürSigma'dan (St. Louis, MO) idi. XTT (2,3-bis-(2‑metoksi‑4-nitro-5-sulfophenyl)−2H-tetrazolium-5-carboxanilide) hücre proliferasyon testi, Roche Diagnostics'ten (Filderstadt, Almanya) satın alındı. Kaspaz 3/7 substratı (Z-DEVD-R110), Bachem'den (Bubendorf, İsviçre) elde edildi ve mitokondriyal potansiyel sensörü JC-1, Molecular Probes'tan (San Diego, CA) elde edildi.

        İçin ksenograft farelerde tedavi Momundo ekstresi ile yıkanıp HP-β-CD kompleksleri meydana gelmiştir. Bunun için öz, etanol/su (1:1, v/v) içinde çözündürüldü ve HP-β-CD, etanol içinde çözündürüldü. Her iki solüsyon 2.5 saat süreyle 1:11 kütle oranında karıştırıldı ve vakumla konsantre edildi, ardından liyofilizasyon yapıldı. Kompleksler , Momundo özütünün %0.9 NaCl içinde in vivo uygulaması için kullanıldı .Özler


        Ticari Momundo kapsülleri olarak elde edilen Momundo özütü , doğrudan DMSO içinde çözündürüldü. Momundo-ACN özü, sürekli karıştırma sırasında oda sıcaklığında 1 saat boyunca asetonitril içinde 80 mg/ml kapsül içeriğinin maserasyonuyla hazırlandı . Santrifüjden sonra süpernatan yeni bir tüpe aktarıldı ve çözücü bir nitrojen akımı altında buharlaştırıldı ( Şekil 1 A).
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (827KB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şekil 1 . Momundo Artemisia annua özlerinin fraksiyonlanması ve analitik karakterizasyonu . (A) Ekstrakt hazırlığının şematik sunumu. ACN, asetonitril . (B) 210 nm'de Momundo ve Momundo-ACN özütlerinin HPLC-DAD parmak izi ve tanımlanan bileşiklerin kimyasal yapıları. (C) UHPLC-MS/MS ile izole edilmiş bileşiklerin miktar tayini, ortalama ± SD, n  = 3. (D) Momundo ekstreleri , HPLC-MS/MS ile analiz edildiği gibi artemisinin içermez .Momundo ekstraktlarının fraksiyonlanması ve analitik karakterizasyonu


        Artemisia annua ekstraktlarının parmak izi karakterizasyonu ve fraksiyonasyonu yarı hazırlayıcı HPLC ile yapıldı . HPLC sistemi, düşük gradyanlı bir LC-9A Shimadzu pompasından (Kyoto, Japonya), otomatik numune enjektörü Aspec'ten oluşuyordu.XL (Abimed, Langenfeld, Almanya), kolonlu fırın IWN CH100 (Junedis, Gröbenzell, Almanya), bir fotodiyot dizi dedektörü UVD 340 U (Dionex, Idstein, Almanya) ve bir fraksiyon toplayıcı (Gilson, Limburg-Offheim, Almanya) Chromeleon Yazılımı sürüm 6.6 (Dionex) çalıştıran bir bilgisayara bağlı. Ayırma ve fraksiyonlama için bir ön kolon (Phenomenex, SecurityGuard, C18, 4 x 3 mm) ve bir yarı-preparatif kolon (Phenomenex, Synergi Hydro-RP, 4 um, 80 Â, 250 x 10 mm) kullanıldı. 100 mg/ml Momundo-ACN özütü, DMSO içerisinde çözündürüldü ve enjeksiyondan önce 0.45 um'lik bir membran filtreden süzüldü. Akış hızı 5000 ul/dakika ve enjeksiyon hacmi 200 ul idi. Fotodiyot dizi dedektörü, absorbans takibi için 210 nm'ye ayarlandı. seyrelme eğilimieluent A (deiyonize, ultra saf su + %0.05 formik asit) ve eluent B'den (asetonitril + %0.05 formik asit) oluşuyordu. Prosedürün ayrıntıları Kısa Veriler makalesinde açıklanmıştır.

        Ana piklere, a, b, c, d, e'ye ( Şekil 1 B) karşılık gelen fraksiyonlar toplandı ve çözücü çıkarıldı. Yapılar HPLC-MS/MS ile alıkonma süreleri, kütle spektrumları ve parçalanma kütle spektrumları referans standartlarla karşılaştırılarak tanımlandı. Doruk B (chrysosplenol D) 'ye ek tabi tutuldu 1 H- ve 13 bir Bruker DRX 500 NMR spektrometresi C NMR spektroskopisi. HPLC-MS/MS analizi, bir elektrosprey iyonizasyon yoluyla bir AB API 2000 (Applied Biosystems, Foster City, CA) üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi ile birleştirilmiş bir Agilent 1260 Infinity sistemi (Agilent, Santa Clara, CA) üzerinde gerçekleştirildi.(ESI) kaynağı. Toplanan veriler Analyst 1.6.1 yazılımı (Ab Sciex, Framingham, MA) ile işlendi.

        Ana bileşenlerin miktar tayini, bir ön sütunlu (Phenomenex, SecurityGuard, C18, 4 x 2 mm) bir analitik UHPLC kolonu (Dr. Maisch ReproSil-Pur Basic-C18, 1.9 um, 75 x 2 mm) kullanılarak yapıldı. Akış hızı 350 µl/dk ve enjeksiyon hacmi 2 µl idi. Mobil faz elüent A (ultra saf su +% 0.05 formik asit) ve yıkama sıvısı B'nin (asetonitril +% 0.05 formik asit) oluşmaktaydı. Başlangıç ​​koşulları, %70 eluent A ve %30 eluent B idi, ardından 6.9 dakika boyunca %95 eluent B'ye doğrusal bir gradyan, ardından 9.1 dakikaya kadar %95 eluent B idi. Daha sonra, 9,5 dakikaya kadar başlangıç ​​koşullarına doğrusal bir gradyan ve 12,5 dakikaya kadar yeniden dengeleme uygulandı. Kromatografik sistemi stabilize etmek için kolon 28°C sıcaklıkta tutuldu.°C. MS/MS analizi, pozitif atmosferik basınç ESI modunda ve çoklu reaksiyon izleme (MRM) algılama modunda gerçekleştirilmiştir. 6,7-dimetoksikumarin için m/z 207.1'deki öncü iyon ve m/z 151.1'deki en yüksek yoğunluğa sahip ürün iyonu seçildi. Benzer şekilde, en iyonları , m / z 361.3 ve 327.8 chrysosplenol D kullanıldı, m / z 375.4 ve 342.0 casticin ve kullanıldı , m / z 249.3 ve 142.9 B. Arteannuic asit negatif iyonizasyon modunda analiz edildi Arteannuin için kullanılmış ve içinde izleme seçilmiş iyonun en (SİM) algılama modu , m / z233.2. Bileşiklerin miktar tayini, harici bir kalibrasyon yöntemi kullanılarak yapıldı. Karakterizasyon ve doğrulama verilerinin ayrıntıları Kısa Veriler makalesinde açıklanmıştır.Hücre kültürü


        Cell Biolabs, Inc.'den (San Diego, CA) alınan ateş böceği lusiferazını kararlı bir şekilde eksprese eden MDA-MB-231 hücreleri , Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM, 4.5 g/l glukoz, GlutaMax; Life Technologies, Carlsbad, CA) kültürlendi. %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 0.1 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin ve 100 mg/ml streptomisin ile . American Type Culture Collection'dan (ATCC, Rockville, MD) alınan normal meme epitel hücreleri hTERT-HME1, MEGM ortamında (Lonza, Basel, İsviçre) kültürlendi. Ek olarak kullanılan hücre hatları MCF-7, MIA PaCa-2, PC-3 ve A549, ATCC'den alındı ​​ve tedarikçinin tavsiyelerine göre kültürlendi. Periferik kan mononükleer hücreleri(PBMC), sağlıklı donörlerin tam kanından Biocol (Biochrom GmbH, Berlin, Almanya) kullanılarak yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile izole edildi ve %10 FCS ile takviye edilmiş 2 mM L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA) RPMI 1640 ortamında kültürlendi. ve penisilin/streptomisin ( Li ve diğerleri, 2012 ). Lenfosit proliferasyonunun analizi için , CFSE lekeli hücreler ekstrakt ile muamele edildi, 72 saat boyunca anti-CD3/CD28 antikorları ile uyarıldı ve daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi ile analiz edildi ( Steinborn ve diğerleri, 2018 ). İnsan kan hücrelerinin kullanıldığı deneyler Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.Hücre canlılığının analizi


        Ekstraktlar, saf bileşikler ve doksorubisin ile muameleden sonra hücre canlılığı , üreticinin talimatlarına (Roche) göre XTT tahlili ile analiz edildi . Absorbans, 630 nm'lik bir referans filtre ile 450 nm'de bir Infinite M1000 PRO Tecan plaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür.Hücre döngüsü analizi


        Momundo, Momundo-ACN, paklitaksel veya %0.5 DMSO ile işleme tabi tutulan MDA-MB-231 hücreleri toplandı ve gece boyunca %70 buz gibi soğuk etanol ile sabitlendi. DNA, DNAz içermeyen RNaz A içeren bir tampon içinde propidyum iyodür ile boyandı ( Morad ve diğerleri, 2011 ) ve hücreler, bir FACCSVerse sitometresi (Becton Dickinson, Heidelberg, Almanya) ve FlowJo yazılımı (FlowJo LLC, Ashland ) kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi. , VEYA). Hücreler, yukarıdaki gibi tedavi, ancak, 24 saat boyunca, boyandı Alexa Fluor ® 488 α-tübülin antikoru (Celi Signalling Technology, Danvers, MA) ve Hoechst 33342 ( El Gaafary ve ark. 2017 ) ve bir Ti-e ters ile görüntülenmiş x40 objektif kullanan floresan mikroskobu (Nikon, Düsseldorf, Almanya).apoptoz analizi


        Mitokondriyal potansiyel kaybı (ΔΨm), mitokondride potansiyele bağlı bir şekilde biriken lipofilik katyonik JC-1 boyası kullanılarak akış sitometrik olarak analiz edildi ( El Gaafary ve diğerleri, 2015 ). 48 ve 72 saat boyunca Momundo özütü veya paklitaksel ile tedavi edilen hücreler, 37°C'de 20 dakika boyunca DMEM (4.5 g/l glukoz) içinde 10 ug/ml JC-1 boyası ile inkübe edildi.°C. ΔΨm kaybı, FlowJo yazılımı tarafından kırmızı/yeşil floresan yoğunluk oranında bir azalma olarak analiz edildi. Kaspaz 3/7 aktivasyonunun analizi için hücreler 1 saat 37°C'de inkübe edildi.°C, 100 μM florojenik kaspaz 3/7 substratı Z-DEVD-R110 varlığında. Floresan kaspaz 3/7 ürünü, akış sitometrisi ile tespit edildi. DNA fragmantasyonu in vitro olarak, hücre döngüsü analizi protokolü kullanılarak propidium iyodür ile boyanmış, 48 saat boyunca işleme tabi tutulmuş MDA-MB-231 hücrelerinde akış sitometrisi ile analiz edildi.tümör ksenograftları


        Hayvan deneyleri, ilgili makamlar tarafından onaylanmış ve izin verilmiş olup, uluslararası ve ulusal yönergelere göre yapılmıştır. 1 x 10 6 , MDA-MB-231 hücreleri, orta / matrigel içinde piliç chorioallantoic membran ı (CAM) üzerinde aşılandı (1: 1, h / h) 7 gün sonra gübreleme . Sonraki 3 gün, ksenograftlar topikal olarak 20 ul ekstrakt veya %0.5 DMSO ile tedavi edildi. Tümör biyolüminesansı , tedavinin 4. gününde IVIS in vivo Görüntüleme Sistemi (PerkinElmer, Waltham, MA) kullanılarak d- lusiferin (0.75 mg/ml, 10 ul/yumurta) uygulamasından 5 dakika sonra ölçülmüştür . Daha sonra tümörler toplandı, sabitlendi ve parafine gömüldü. İmmünohistokimyasal analiz için, 5 µm kesitler ile zıt boyama yapıldı.hematoksilen , eozin ve proliferasyon markeri Ki-67'ye (M7240, Dako, Glostrup, Danimarka) karşı antikorlar kullanılarak ayrıca analiz edildi. Apoptoz analizi için , in vivo DNA zincir kırıkları , üreticinin protokolüne (Roche) göre terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik ucu etiketlemesi (TUNEL) ile görselleştirildi . Görüntüler bir Axio Lab.A1 mikroskobu (Carl Zeiss, Göttingen, Almanya) ve bir Zeiss 2/3" CMOS kamera ile Progres Gryphax yazılımı (Carl Zeiss) kullanılarak kaydedildi. Tümör hacmi (mm 3 ), şu formül kullanılarak değerlendirildi: uzunluk (mm) x genişlik² (mm) x π/6.

        İçin ksenonaklinin farelerde, 0.5 x 10 6 , MDA-MB-231 içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler fosfat tamponlu tuzlu su ortotopikal yoldan implante edildi meme bezi 8-9 haftalık dişi NMRI- arasında Foxn1 nu / nu fareleri (Janvier, Le Genest-St.- Adası, Fransa). Ksenonakilden fareler (8 fare / grup) 8 gün sonra başlayarak tedavi edildi ip 100 mg kg -1 gün -1 Momundo HP-β-CD, 2 mg kg -1 hafta -1 doksorubisin ya da 1000 mg kg -1 gün -1çözücü (HP-β-CD) 3 hafta süreyle. Tümör hacimleri 0,5 x uzunluk x genişlik x kalınlık formülüne göre hesaplandı. Deney sonunda anestezi uygulanmış hayvanlardan kardiyak ponksiyon ile alınan kan, standart yöntemler kullanılarak hastanenin klinik kimya laboratuvarında karaciğer enzimlerinin varlığı açısından analiz edilmiştir .istatistiksel analiz


        Sonuçlar, en az üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM'si olarak ifade edilir. İki grup karşılaştırması durumunda, sonuçlar iki kuyruklu Student t testi ile analiz edildi . Tek yönlü varyans analizi kullanılarak çoklu grup analizi yapıldı, ardından SigmaPlot yazılımı kullanılarak Newman-Keuls post hoc testi yapıldı . Anlamlılık seviyeleri * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 olarak belirlendi.Sonuçlar

        Momundo Artemisia annua özütünün fraksiyonlanması ve kimyasal karakterizasyonu


        İki Artemisia annua özütü, Momundo'nun Momundo ve asetonitrilde çözünür fraksiyonu (Momundo-ACN) HPLC ile karakterize edildi ( Şekil 1 B). Ekstraktlar, (a) 6,7-dimetoksi-kumarin, (b) krizosplenol D, (c) kastisin, (d) arteannuin B ve (e) arteannüik asit ( Şekil 1 B) ana bileşenlerini içerir . Şekil 1 C, Momundo'ya kıyasla Momundo-ACN'de önemli ölçüde daha yüksek olan ekstrelerdeki tanımlanmış bileşiklerin miktarlarını gösterir. Artemisinin Momundo özütlerinde saptanamadı ( Şekil 1 D).Momundo Artemisia annua özleri, meme kanseri hücrelerinde hücre döngüsü durmasına neden olur


        Floresan mikroskobuyla yapılan morfolojik analiz , meme kanseri hücre tedavisinden sonraki 24 saat içinde, Artemisia annua özütlerinin, özellikle Momundo-ACN'nin, paklitaksel'e benzer şekilde , çok çekirdekli, çoğunlukla 4 N hücre oluşumunu indüklediğini gösterir ( Şekil 2 A). Bu zaman noktasında, Momundo özütü , apoptotik hücre sayısında yalnızca hafif bir artışla kanser hücrelerine toksisite göstermedi ( Şekil 2 A,C ve Kısa Veri makalesi). Hücre döngüsü analizi , paklitaksele benzer şekilde Artemisia annua özütü ile yapılan tedavinin tetraploid popülasyonlarını arttırdığını doğruladı.(4 N) MDA-MB-231 hücreleri ve hücre döngüsünün S-fazındakiler ( Şekil 2 B) ve poliploid (≥ 8 N) hücre sayısı, sonrasında sayısı daha da arttı. 48 saat ( Şekil 2C). S-fazı hücre popülasyonundaki artış, apoptozun ve 4 N hücre tarafından DNA içeriğinin kaybının bir sonucu olabilir .
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (1MB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şekil 2 . Momundo Artemisia annua özü, hücre döngüsü ilerlemesini engeller ve meme kanseri hücrelerinde sitokinez yetmezliğine neden olur . (A) MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri hücreleri, 24 saat boyunca Momundo (100 ug/ml), Momundo-ACN (30 ug/ml) veya paklitaksel (100 nM) ile tedavi edildi , anti-tubulin antikoru ile boyandı ve Hoechst 33342 ve mikroskobik olarak analiz edildi. Grafik, çok çekirdekli hücrelerin yüzdesini gösterir. (B) Hücreler, 48 saat boyunca 100 ug/ml ekstrakt veya paklitaksel (100 nM) ile işleme tabi tutuldu, propidium iyodür ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. (C) Momundo-ACN, poliploid oluşumunu indükler(≥ 8 N) hücreler. Hücreler (A)'daki gibi işlendi ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Veriler ortalama ± SEM, n  = 3, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001'dir.Momundo Artemisia annua özleri, tedaviye dirençli kanser hücre hatlarının canlılığını seçici olarak azaltır


        Artemisia annua özleri konsantrasyona ve zamana bağlı olarak MDA-MB-231 hücrelerinin canlılığını engeller. Momundo-ACN özü, MDA-MB-231 hücrelerine karşı önemli ölçüde daha yüksek sitotoksisite sergiledi ve bir IC ile canlılığını inhibe 50 18 ug / ml Momundo özü IC ile karşılaştırıldığında 50 > 100 ug / ml, 48 saat sonra ( Şek. 3 A). Bu nedenle, asetonitril ekstraksiyonu, lipofilik sitotoksik bileşiklerin zenginleşmesiyle sonuçlandı. Momundo-ACN özütü, benzer şekilde , belirli bir tümör dokusu için spesifiklik olmadığını ve her ikisinin de yaşayabilirliği olarak hormon reseptörlerinin ekspresyonuna bağlı olmadığını gösteren , çeşitli tedaviye dirençli kanser hücre hatlarına karşı sitotoksikti .meme kanseri hücre dizileri , TNBC MDA-MB-231 ve MCF-7 etkilenmiştir. İnsan NSCLC A549 hücreleri, bir IC ile Momundo-ACN karşı en hassas olan 50androjenden bağımsız PC-3 prostat kanseri hücreleri, IC ile en dayanıklı olanlar olduğu, oysa 8 ug / ml50ug / ml (56Şek. 3B). Önemli olarak,Artemisia annuaözleri kanser hücrelerine karşı seçicilik gösterir, çünkü Momundo-ACN ≤ 30 µg/ml'de normal meme epitel hücrelerine ve PBMC'ye karşı hiçbir toksisite göstermezken, 30 µg/ml'deMDA-MB-231'in canlılığını inhibe etti. yaklaşık %72 (Şekil 3C). Ayrıca lenfosit proliferasyonu72 saat boyunca Momundo özütü ile muameleden etkilenmedi ( Şekil 3 D).
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (511KB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şekil 3 . Momundo Artemisia annua özleri, çeşitli kanser hücrelerinin canlılığını seçici olarak inhibe eder . (A) Momundo özleri, meme kanseri hücrelerinin MDA-MB-231, doksorubisin – pozitif kontrol canlılığını inhibe eder . (B) Momundo-ACN özütü, XTT ile analiz edildiği üzere çeşitli tedaviye dirençli kanser hücre dizileri için sitotoksiktir . NSCLC, küçük hücreli dışı akciğer kanseri. (C) Normal meme epitel hücreleri ve PBMC , Momundo-ACN'ye (48 saat) nispeten dirençlidir. (D) Lenfosit proliferasyonu Momundo özünden etkilenmez. Hücreler CFSE ile boyandı , ekstrakt ile işlendi, 72 saat boyunca CD3/CD28 antikorları ile aktive edildi ve akış sitometrisi ile analiz edildi.Siklosporin A (5 ug/ml) pozitif kontrol olarak görev yaptı. Tüm veriler ortalama ± SEM, n  = 3 - 5'tir .Momundo Artemisia annua özü , in vitro meme kanseri hücrelerinde apoptozu indükler


        Momundo Artemisia annua ekstrelerinin sitotoksisitesinin apoptoz indüksiyonundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için birkaç apoptotik parametre analiz edildi ( Okada ve Mak, 2004 ). Gerçekten de, Momundo veya Momundo-ACN özütü ile 48 saat tedavi edilen hipodiploid DNA içeriğine sahip hücrelerin sayısı önemli ölçüde arttı. Paklitaksel ile tedavi edilen hücrelerde hipodiploid apoptotik hücre popülasyonunda benzer bir artış gözlendi ( Şekil 4 A).
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (809KB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şekil 4 . Momundo Artemisia annua özleri , in vitro olarak apoptozu indükler . (A) MDA-MB-231 hücreleri 48 saat boyunca işleme tabi tutuldu, propidium iyodür ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Apoptotik hipodiploid hücrelerin yüzdesi gösterilmiştir. (B) Hücreler, (A)'daki gibi 48 veya 72 saat işlendi, JC-1 ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Depolarize mitokondriyal membranlı hücreler (ΔΨ m ) gösterilmiştir. (C) Hücreler 48 saat süreyle işleme tabi tutuldu, florojenik kaspaz-3 substratı Z-DEVD-R110 ile inkübe edildi ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Veriler ortalama ± SEM, n  = 3-4, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
        Mitokondri, proapoptotik proteinleri sitoplazma aktive eden kaspaz 3'e salarak apoptozu teşvik eder ( Okada ve Mak, 2004 ). Artemisia annua ile indüklenen apoptozda içsel mitokondriyal yolun dahil olduğunu göstermek için mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨ m ) analiz edildi. Meme kanseri hücrelerinin Momundo özü veya paklitaksel ile tedavisi, mitokondriyal membran potansiyeli azaltılmış hücrelerin yüzdesini sırasıyla %4.0'dan % 18.1'e ve %43.4'e yükselterek mitokondriyal membran geçirgenliğini doğruladı ( Şekil 4B). Bu verilerle uyumlu olarak, Momundo özütü ayrıca Artemisia annua özütü tarafından içsel apoptozun indüklendiğini doğrulayan kaspaz 3 aktivasyonunu da indükledi ( Şekil 4C). Bununla birlikte, kanser hücrelerinin bir kaspaz 8 inhibitörü olan IETD ile ön tedavisi , ekstre toksisitesini azalttığı, ancak sadece Momundo-ACN ekstresinin en yüksek konsantrasyonunda (50 µg/ml) olduğundan, dışsal yolun aktivasyonu tamamen dışlanamaz ( Kısa makaledeki veriler). Kaspaz 3'ün, kaspaz 8'e kıyasla çok daha düşük etkinliğe sahip olmasına rağmen ( Pop ve Salvesen, 2009 ) IETD'yi de parçalayabildiğini ve dolayısıyla IETD tarafından da inhibe edilebileceğini belirtmekte fayda var .Artemisia annua özleri, CAM üzerinde yetiştirilen meme kanseri ksenograftlarının büyümesini engeller


        CAM üzerinde büyütülen MDA-MB-231 meme kanseri ksenograftları ( Syrovets ve diğerleri, 2005 ) , Momundo ekstrelerinin in vivo antitümör aktivitesini doğrulamak için kullanıldı . Tedavi xenografts Momundo ve Momundo-ACN ile bağlı bir doz, tümör hacminin (indirgenmiş Şek. 5 A). Tümörlerin immünohistokimyasal analizi, Artemisia annua özleri tarafından kanser hücresi çoğalmasının inhibisyonunu ortaya çıkardı . Böylece, Momundo veya Momundo-ACN ile tedavi, çoğalma işaretçisi Ki-67'nin ifadesini önemli ölçüde azalttı ( Şekil 5 B,C). Ayrıca, Momundo Artemisia annuaözü , in vivo olarak DNA iplikçik kırılmalarının ve apoptozun indüklendiğini gösteren apoptotik TUNEL pozitif hücrelerin sayısını etkili bir şekilde arttırdı ( Şekil 5 D). Özellikle tavuk embriyosunda açık sistemik toksisite gözlemlenmemiştir.
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (2MB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şek. 5 . Artemisia annua özleri, büyümeyi inhibe eder ve in vivo meme kanseri ksenograftlarının apoptozunu indükler . Koryoallantoik civciv zarları (CAM) üzerinde büyütülen MDA-MB-231 ksenograftları , birbirini izleyen 3 gün boyunca her iki ekstreden de 20 ul ile muamele edildi. 4. günde, ksenograftlar yaşam görüntüleme ve immünohistokimyasal olarak analiz edildi. Doksorubisin (1 µM) – pozitif kontrol. (A) Hematoksilen ve eozin boyama (1. sıra), ekstraksiyondan sonra tümör görüntüleri (2. sıra), lusiferin ilavesinden sonra yumurtadaki tümörlerin biyolüminesans görüntülemesi(3. sıra), proliferasyon markeri Ki-67 (4. sıra, kırmızı-kahverengi nükleer boya, orijinal büyütme 200x). (B) Grafikler ortalama tümör hacimlerini gösterir. (C) Çoğalan Ki67 + hücrelerinin miktar tayini . (D) Momundo özü, meme kanseri ksenogreftlerinde apoptozu indükler. TUNEL + hücrelerinin temsili resimleri ve miktar tayini . Tüm veriler, n  ≥ 5 tümör/grubun ortalama ± SEM'si, Kruskal-Wallis testi ve Dunn'ın post-hoc çoklu grup testi veya 2 grup için Mann-Whitney sıralama toplamı testidir , * p < 0.05, ** p < 0.01.Momundo özü ile tedavi, farelerde insan meme kanseri ksenograftlarının büyümesini engeller


        Ek olarak, Momundo özütünün antikanser aktivitesi, farelerde ortotopik bir meme kanseri modelinde analiz edildi. Hayvanların 3 hafta boyunca Momundo özü ile günlük tedavisi, meme kanseri ksenogreftlerinin tümör büyümesini standart kemoterapötik doksorubisin ile benzer ölçüde geciktirdi ( Şekil 6 A). Momundo özünden farklı olarak yüksek toksisitesi nedeniyle doksorubisin haftada bir kez uygulandı. Buna göre, doksorubisin ile tedavi edilen farelerde vücut ağırlığı azalırken, Artemisia annua özütü ile tedavi edilen hayvanlar vücut ağırlığında hafif bir artış bile gösterdi ( Şekil 6 B). Ek olarak, doksorubisin, önemli ölçüde artan AST ve ALT karaciğer enzimi ile kanıtlandığı gibi hepatik toksisite sergilemiştir.plazma seviyeleri. Bu parametreler Momundo özütü ile tedavi edilen farelerde önemli ölçüde daha düşüktü ve bu da Momundo Artemisia annua özütünün daha düşük sistemik toksisitesi olduğunu düşündürdü ( Şekil 6 C).
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (258KB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şekil 6 . Artemisia annua özü Momundo , farelerde in vivo olarak ortotopik meme kanseri ksenograftlarının büyümesini engeller . 8 günlük ortotopik MDA-MB-231 ksenograftları için önceden oluşturulmuş fareler, günlük ip olarak tedavi edildi . 3 ardışık hafta boyunca 100 mg kg- 1 gün- 1 Momundo özütü veya siklodekstrin çözücü ile veya haftada bir kez 2 mg kg- 1 hafta -1 doksorubisin ile . (A) Tedavi başlangıcında ölçülen ortalama tümör hacmine normalize tümör büyümesi. (B) Fare vücut ağırlığı. (C) Momundo düşük karaciğer toksisitesi sergiler. Veriler, n'nin ortalama ± SEM'idir  grup başına  = 8 (A, B) ve n = 4 (C) fare; , Kruskal-Wallis ve Dunn post-hoc testi (A), Newman-Keuls testi (B) * p <0.05   vs , kontrol ve # p <0.05  vs , doksorubisin.Momundo Artemisia annua özü içeriği meme kanseri hücreleri için sitotoksiktir.


        Artemisia annua özütünün ana bileşenleri, arteannuin B, castisin, chrysosplenol D, arteannuic asit ve 6,7-dimetoksikumarin olarak tanımlandı ( Şekil 1 A). Arteannüik asit ve 6,7-dimetoksikumarin tarafından kanser hücresi yaşayabilirliğinde herhangi bir azalma indüklenmezken, arteannuin B, castisin ve chrysosplenol D, MDA-MB-231 hücre canlılığını zaten 24 saat içinde güçlü bir şekilde inhibe etti ( Şekil 7 ). Bu sonuçlar, Momundo Artemisia annua özütünün artemisinin içermemesine rağmen , TNBC hücrelerine karşı güçlü sitotoksik aktiviteye sahip ek doğal bileşikler içerdiğini göstermektedir.
        1. İndir : Yüksek çözünürlüklü görüntüyü indirin (196KB)
        2. İndir : Tam boyutlu resmi indir

        Şek. 7 . Momundo özünden elde edilen saflaştırılmış bileşikler, meme kanseri hücrelerinin canlılığını azaltır . MDA-MB-231 hücreleri 24 saat boyunca işleme tabi tutuldu ve XTT ile analiz edildi, n  = 3 - 5.Tartışma


        Bitkisel müstahzarlar olarak pazarlanan Artemisia annua özleri, farmasötik içerikleri ve terapötik etkinlikleri yeterince çalışılmamış olmasına rağmen, genellikle kötü huylu hastalıklardan muzdarip kişiler tarafından alınır (Alsanad ve diğerleri, 2016;Michaelsen ve diğerleri, 2015). Bu çalışmada, 1), özelliği bir parçalara sahipArtemisia annua, 2) özü sergilediğini göstermiştir bitkisel preparasyon olarak pazarlanan özü anti-kanser aktivitesi in vitrovein vivo olarakaktif bileşiklerini tanımlanır) ve 3Artemisia annuayanında artemisinin , burada kudreti potansiyel olarak daha fazla araştırmaya değerantikanser ajanlar .

        Artemisia annua özütünün analitik karakterizasyonu için , 0,2 ng/mg özüt saptama limiti ile artemisinin saptanmasını sağlayan oldukça hassas bir HPLC-MS/MS yöntemi geliştirildi. İlginç bir şekilde, yüksek analitik duyarlılığa rağmen Momundo preparasyonunda artemisinin tespit edemedik. Bununla birlikte, Momundo özütü, ekstraktın araştırmaya değer diğer biyolojik olarak aktif bileşikleri içerdiğini gösteren antikanser etkinliği gösterdi. Bir Momundo kapsülünün içeriği ACN ile özütlendiğinde, elde edilen kuru özüt (Momundo-ACN) , DMSO'da doğrudan çözünen Momundo kapsül içeriğine kıyasla meme kanseri hücrelerine karşı daha yüksek sitotoksisite sergilemiştir.. Bu, Artemisia annuaözünde lipofilik sitotoksik bileşenlerin varlığına işaret etti . Bu sonuçlar, daha lipofilik metilen klorür ekstraktlarının HeLa kanser hücrelerine karşı daha yüksek polariteye sahip bileşenler içeren metanolik ekstraktlardan daha sitotoksikolduğunu gösteren bir çalışma ile tutarlıdır(Efferth ve diğerleri, 2011).

        Önemli olarak, Momundo-ACN Artemisia annua özütü, farklı dokulardan elde edilen çeşitli tedaviye dirençli kanser hücre dizileri için sitotoksiktir , ancak farklı hassasiyete sahiptir. Kanser hücre hatlarının ekstraktlara farklı tepkileri , ekstrakt tarafından aktive edilen apoptotik sinyal yolundaki varyasyonlardan kaynaklanıyor olabilir . Bu nedenle, MCF-7 hücreleri, birçok kemoterapötik ajana karşı hücre hattı direncinden sorumlu tutulan kaspaz 3 eksikliğidir ( Yang ve diğerleri, 2001 ). Benzer şekilde, MCF-7 hücreleri daha yüksek bir IC sergiledi 50 değeri Artemisia annua kaspaz 3 eksprese, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücreleri ile karşılaştırıldığında özü.

        Özellikle, normal meme epitel hücrelerinin yanı sıra PBMC'lerin canlılığı, normal hücrelere kıyasla kanser hücrelerine karşı farklı sitotoksisite gösteren kanser hücrelerinin canlılığını güçlü bir şekilde azaltan konsantrasyonlarda etkilenmedi. Uyarılmamış PBMC'ler çoğalmayan hücrelerdir ve bu onların Artemisia annua özüne karşı dirençlerini açıklayabilir . Bununla birlikte, çoğalan lenfositler, kanser hücrelerinde hücre döngüsü ilerlemesini açıkça hedefleyen Artemisia annua özütü ile tedaviye de dirençliydi . Ekstre ile tedavi edilen farelerin , doksorubisin ile tedavi edilenlere kıyasla kilo kaybı ve hepatotoksisiteden muzdarip olmadığını da belirtmekte fayda var.. Bu, Momundo'nun bariz bir potansiyel faydasıdır, çünkü tümör hastaları sıklıkla kaşeksiden ciddi şekilde etkilenir .

        Bu bulgular bizi, artemisinin yanında potansiyel antikanser bileşenlerini belirlemek amacıyla Momundo Artemisia annua özünü analiz etmeye ve parçalara ayırmaya teşvik etti .

        Sürdürülen proliferatif sinyalleşme ve düzensiz hücre döngüsü kontrolü , çoğu neoplazinin ortak özellikleridir ( Hanahan ve Weinberg, 2011 ). Momundo özü tedavisi , meme kanseri hücrelerinde konsantrasyona bağlı hücre döngüsü bozulmalarını ve sitokinez yetmezliğini ( Lens ve Medema, 2019 ) indükledi . Doğrudan DNA ile etkileşime giren kuersetin gibi flavonoidler için de benzer etkiler tarif edilmiştir ( Srivastava ve diğerleri, 2016 ). Quercetin, özünde oldukça yüksek konsantrasyonlarda tanımladığımız chrysosplenol D ve castisinin yapısal olarak ilişkili bir bileşiğidir. Momundo Artemisia annua'nın diğer bileşenleriözü ayrıca, paklitaksele benzer şekilde , anormal mitoz ve çok çekirdekli hücrelerin birikmesine yol açan mikrotübül dinamiklerini etkileyebilir ( de Leeuw ve diğerleri, 2015 ; Morris ve Fornier, 2008 ).

        Giden ilaçlar apoptoz apoptotik hücrelerin etkin bir bağışıklık hücreleri tarafından kaldırılır gibi kanser tedavisi için özellikle ilgi çekici olan , in vivo ( Wong 2011 ). Mevcut veriler, meme kanseri hücrelerinin Momundo Artemisia annua özütü ile tedavisinin , mitokondriyal membran potansiyeli , kaspaz 3 aktivasyonu ve DNA parçalanması ile tipik apoptoz belirtilerini indüklediğini ortaya koymaktadır . Ayrıca, ksenograft modellerinin Momundo özü ile tedavisi, in vivo olarak apoptoz indüksiyonunu gösterdi . Bu etkiler açıkça Artemisia annua'nın iyi bilinen artemisinin yanı sıra terapötik potansiyele sahip aktif maddeler içerir.

        Momundo-ACN özütünün fraksiyonlanması, beş ana bileşenin tanımlanmasını sağladı. Bunlardan üçü, arteannuin B, castisin ve chrysosplenol D, ekstraktın tümör büyümesi üzerindeki inhibitör etkinliğine sinerjik olarak katkıda bulunabilir. Flavonoidler chrysosplenol D ve kastisinin MDA-MB-231 hücrelerine karşı sitotoksisitesi, yapısal olarak ilişkili flavonoid kersetin için bildirilenden bile daha yüksekti ( Chien ve diğerleri, 2009 ). Bunun nedeni, daha lipofilik bir moleküle yol açan metoksillenmiş flavonol yapısı ve hücre zarlarından daha iyi nüfuz etme kabiliyeti olabilir.Çözüm


        Bu çalışma bir kanıt sağlar antikanser aktivitesi bir ait Artemisia annua bir olarak pazarlanan özü bitkisel preparat . Sonuçlar birlikte, Artemisia annua türevli bileşiklerin yeni anlayışlarını , bunların antikanser tedavisindeki potansiyel etkinliklerini ortaya koyuyor ve artemisinin farklı olan yüksek metastatik üçlü negatif insan meme kanseri hücrelerine karşı aktiviteye sahip bileşikleri ortaya çıkarıyor . Ek olarak, çalışma, bir bitkisel preparatta terapötik olarak aktif bileşikler için kanıt sağlar. Bu bulgular, bu bileşiklerin terapötik amaçlar için daha fazla araştırılmasını haklı çıkarmaktadır.Etik standartlara uygunluk


        Çıplak farelerle yapılan deneyler , Baden-Württemberg Eyaleti Hayvan Refahı ve Koruma Dairesi tarafından onaylanmıştır (referans numarası 1408). İnsan kanının toplanması ve periferik kan mononükleer hücrelerinin analizi , Üniversitenin Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası 177/18). Gönüllüler çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.Teşekkür


        Bu çalışma, Baden-Württemberg Eyaleti Bilim, Araştırma ve Sanat Bakanlığı Tamamlayıcı ve Bütünleştirici Tıp Akademik Merkezi (AZKİM) tarafından desteklenmiştir . Uzman teknik yardım için Felicitas Genze ve Eva Winkler'a teşekkür ederiz.Çıkar çatışması


        Yazarlar, yayınla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını ve sonucu etkileyebilecek herhangi bir finansal destek olmadığını belirtmişlerdir.Ek . tamamlayıcı malzemeler


        İndir : Word belgesini indirin (412KB)

        Ek Materyal 2: Deneylerle ilgili ek bilgilerReferanslar

        Alsanad ve diğerleri, 2016 SM Alsanad , RL Howard , EM Williamson
        Kanser hastaları tarafından kullanılan bitki-ilaç kombinasyonlarının etkisinin değerlendirilmesi
        BMC Tamamlayıcı Alter Med , 16 ( 2016 ) , s. 393
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Atanasov ve diğerleri, 2015 AG Atanasov , B. Waltenberger , EM Pferschy-Wenzig , T. Linder , C. Wawrosch , P. Uhrin , V. Temml , L. Wang , S. Schwaiger , EH Heiss , JM Rollinger , D. Schuster , JM Breuss , V . Bochkov , MD Mihovilovic , B. Kopp , R. Bauer, VM Dirsch , H. Stuppner
        Farmakolojik olarak aktif bitki kaynaklı doğal ürünlerin keşfi ve yeniden tedariği: bir inceleme
        Biotechnol Adv , 33 ( 2015 ) , s. 1582 - 1614
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Breuer ve Efferth, 2014 E. Breuer , T. Efferth
        Artemisia annua ile demir yüklü veteriner sarkomunun tedavisi
        Nat Prod Bioprospect , 4 ( 2014 ) , s. 113 - 118
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Chien ve diğerleri, 2009 SY Chien , YC Wu , JG Chung , JS Yang , HF Lu , MF Tsou , WG Wood , SJ Kuo , DR Chen
        Quercetin kaynaklı apoptoz, insan meme kanseri MDA-MB-231 hücrelerinde mitokondriyal ve kaspaz-3'e bağlı yolaklar yoluyla etki eder
        Hum Exp Toxicol , 28 ( 2009 ) , s. 493 - 503
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik de Leeuw ve diğerleri, 2015 R. de Leeuw , LD Berman-Booty , MJ Schiewer , SJ Ciment , RB Den , AP Dicker , WK Kelly , EJ Trabulsi , CD Lallas , LG Gomella , KE Knudsen
        Yeni nesil taksanların yeni eylemleri, prostat kanserinin ileri evrelerine fayda sağlıyor
        Clin Cancer Res , 21 ( 2015 ) , s. 795 - 807
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Eferth, 2017 T. Efferth
        Antik bitkiden modern ilaca: Kanser tedavisi için Artemisia annua ve artemisinin
        Semin Cancer Biol , 46 ( 2017 ) , s. 65 - 83
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Efferth ve diğerleri, 2011 T. Efferth , F. Herrmann , A. Tahrani , M. Wink
        Artemisia annua L.'den türetilen ikincil metabolitlerin kanser hücrelerine karşı sitotoksik aktivitesi , belirlenmiş aktif bileşen artemisinin ile karşılaştırıldığında
        Phytomedicine , 18 ( 2011 ) , s. 959 - 969
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik El Gaafary ve diğerleri, 2015 M. El Gaafary , B. Büchele , T. Syrovets , S. Agnolet , B. Schneider , CQ Schmidt , T. Simmet
        Bir a-asetoksi-tirukallik asit izomeri, Akt/mTOR sinyalini inhibe eder ve prostat kanseri hücrelerinde oksidatif stresi indükler
        J Pharmacol Exp Ther , 352 ( 2015 ) , s. 33 - 42
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik El Gaafary ve diğerleri, 2017 M. El Gaafary , SM Ezzat , AM El Sayed , OM Sabry , S. Hafner , S. Lang , M. Schmiech , T. Syrovets , T. Simmet
        Acovenosid A, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinde mitotik felaketi ve ardından apoptozu indükler
        J Nat Prod , 80 ( 2017 ) , s. 3203 - 3210
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Ferreira ve diğerleri, 2010 JF Ferreira , DL Luthria , T. Sasaki , A. Heyerick
        Artemisia annua L.'den antioksidanlar olarak flavonoidler ve sıtma ve kansere karşı artemisinin ile potansiyel sinerjileri
        Moleküller , 15 ( 2010 ) , s. 3135 - 3170
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Hanahan ve Weinberg, 2011 D. Hanahan , RA Weinberg
        Kanserin ayırt edici özellikleri: yeni nesil
        Hücre , 144 ( 2011 ) , s. 646 - 674
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Koehn ve Carter, 2005 FE Koehn , GT Carter
        İlaç keşfinde doğal ürünlerin gelişen rolü
        Nat Rev Drug Discov , 4 ( 2005 ) , s. 206 - 220
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Lens ve Medema, 2019 SMA Lens , RH Medema
        Sitokinez kusurları ve kanser
        Nat Rev Cancer , 19 ( 2019 ) , s. 32 - 45
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Li ve diğerleri, 2012 X. Li , T. Syrovets , T. Simmet
        Serin proteaz plazmin, CC-kemokin ligandı 20'nin dendritik hücrelerde Akt/NF-κB'ye bağlı yollar yoluyla ekspresyonunu tetikler
        J Biomed Biotechnol , 2012 ( 2012 ) , Madde 186710
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Michaelsen ve diğerleri, 2015 FW Michaelsen , ME Saeed , J. Schwarzkopf , T. Efferth
        Aktivitesi Artemisia annua prostat kanserinde ve artemisinin türevleri,
        Phytomedicine , 22 ( 2015 ) , s. 1223 - 1231
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Morad ve diğerleri, 2011 SA Morad , C. Schmidt , B. Büchele , B. Schneider , M. Wenzler , T. Syrovets , T. Simmet
        (8R)-3β,8-dihidroksipolipoda-13E,17E,21-trien, tedaviye dirençli prostat kanseri hücrelerinde hücre döngüsü durmasını ve apoptozu indükler
        J Nat Prod , 74 ( 2011 ) , s. 1731 - 1736
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Morris ve Fornier, 2008 PG Morris , MN Fornier
        Mikrotübül aktif ajanlar: taksan sınırının ötesinde
        Clin Cancer Res , 14 ( 2008 ) , s. 7167 - 7172
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Nosrati ve diğerleri, 2018 H. Nosrati , N. Sefidi , A. Sharafi , H. Danafar , H. Kheiri Manjili
        Kurkumin-antikanser ilacı için biyouyumlu taşıyıcılar olarak Bovine Serum Albumin (BSA) kaplı demir oksit manyetik nanopartiküller
        Bioorg Chem , 76 ( 2018 ) , s. 501 - 509
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Okada ve Mak, 2004 H. Okada , TW Mak
        Tümör hücrelerinde apoptotik ve apoptotik olmayan ölüm yolları
        Nat Rev Cancer , 4 ( 2004 ) , s. 592 - 603
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Pop ve Salvesen, 2009 C. Pop , GS Salvesen
        İnsan kaspazları: aktivasyon, özgüllük ve düzenleme
        J Biol Chem , 284 ( 2009 tarihinden bu ) , s. 21777 - 21781
        MaddePDF İndirÇapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Slezakova ve Ruda-Kucerova, 2017 S. Slezakova , J. Ruda-Kucerova
        Artemisinin ve türevlerinin antikanser aktivitesi
        Anticancer Res , 37 ( 2017 ) , s. 5995 - 6003
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Srivastava ve diğerleri, 2016 S. Srivastava , RR Somasagara , M. hegde , M. Nishana , SK Tadi , M. Srivastava , B. Choudhary , SC Raghavan
        Doğal bir flavonoid olan Quercetin, DNA ile etkileşime girer, hücre döngüsünü durdurur ve apoptozun mitokondriyal yolunu aktive ederek tümör gerilemesine neden olur.
        Sci Rep , 6 ( 2016 ) , s. 24049
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Steinborn ve diğerleri, 2018 C. Steinborn , O. Potterat , U. Meyer , R. Trittler , S. Stadlbauer , R. Huber , C. Gründemann
        Equisetum arvense'nin in vitro anti-inflamatuar etkilerine yalnızca silika aracılık etmez.
        Planta Med , 84 ( 2018 ) , s. 519 - 526
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Syrovets ve diğerleri, 2005 T. Syrovets , JE Gschwend , B. Büchele , Y. Laumonnier , W. Zugmaier , F. Genze , T. Simmet
        Asetil-boswellik asitler tarafından IkappaB kinaz aktivitesinin inhibisyonu, androjenden bağımsız PC-3 prostat kanseri hücrelerinde in vitro ve in vivo apoptozu teşvik eder
        J Biol Chem , 280 ( 2005 ) , s. 6170 - 6180
        MaddePDF İndirScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Wang ve diğerleri, 2009 H. Wang , C. Ma , L. Ma , Z. Du , H. Wang , H. Ye , G. Li , B. Liu , G. Xu
        Artemisia annua'nın iki genotipinin ikincil metabolik profili ve artemisinin biyosentezi
        Planta Med , 75 ( 2009 ) , s. 1625 - 1633
        Görünüm PDF
        Çapraz ReferansScopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Wong, 2011 RS Wong
        Kanserde apoptoz: patogenezden tedaviye
        J Exp Clin Cancer Res , 30 ( 2011 ) , s. 87
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik Yang ve diğerleri, 2001 X.-H. Yang , TL Sladek , X. Liu , BR Butler , CJ Froelich , AD Thor
        Kaspaz 3'ün yeniden yapılandırılması, MCF-7 meme kanseri hücrelerini doksorubisin ve etoposid kaynaklı apoptoza duyarlı hale getirir
        Cancer Res , 61 ( 2001 ) , s. 348 - 354
        Görünüm PDF
        Scopus'ta Kaydı GörüntüleGoogle Akademik

        Yorum yap

        Hazırlanıyor...
        X